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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
线粒体是细胞内不可或缺的细胞器，是机体获得能量的主要来源。线粒体产能主要来源于由四个复合物组成的电子传递链，其中线粒体复合物Ⅳ做为线粒体电子传递链中的终末酶复合物，既能传递电子，产生电化学梯度，也能将化学反应释放的能量转变为含高能磷酸键的atp[1]。线粒体复合物Ⅳ的三个最重要亚基（coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ）均由线粒体基因组编码[2]，但线粒体dna复制转录不完善的修复系统使得线粒体基因突变率高[3]，再者由于复合物Ⅳ的结构较其他复合物而言脆弱且不稳定，易受活性氧自由基的攻击[4]，使得亚基结构改变，从而影响线粒体功能，引发一系列的线粒体疾病。研究表明线粒体复合物Ⅳ功能缺陷是人类常见的线粒体疾病[5]。本实验将构建并筛选复合物Ⅳ亚基Ⅰ（coxⅠ）的沉默转化子，进而探究其对灵芝次级代谢的影响。
随着对线粒体复合物Ⅳ结构及组装过程研究的不断深入，人们已确认线粒体复合物Ⅳ在线粒体基因组与核基因组的序列，并以大鼠肝脏线粒体复合物Ⅳ组建cdna文库。真核生物的线粒体复合物Ⅳ含13个亚基，由线粒体基因组编码的coxⅠ、coxⅡ和coxⅢ，主要起电子传递和质子泵的作用，而由核基因组编码的十个亚基（cox4、cox5a、cox5b、cox6a、cox6b、cox6c、cox7a、coa7b、coa7c、cox8a）对复合物Ⅳ的组装起调节和稳定的作用[6]。原核生物的线粒体复合物Ⅳ亚基数量较少，一般只有四个，其中亚基Ⅰ和亚基Ⅱ的结构高度保守，作为功能酶的核心部分，参与氧分子的还原和质子泵的作用[7]。复合物Ⅳ的晶体结构、组装过程已被人们所知，目前人们主要研究线粒体复合物Ⅳ的功能，从而应用于医学、生产生活，李石竹等通过建立复合物Ⅳ亚基Ⅳ载体，并在nb4细胞中过表达发现复合物Ⅳ亚基Ⅳ的缺失会导致ros的积累[8]，加速细胞的凋亡；hillttemann通过敲除小鼠线粒体cox4b，发现小鼠呼吸道张力减弱，且随着年龄增长，此种肺组织的病理会更加严重，最后发展为支气管炎，说明cox4b对于小鼠复合物Ⅳ的活性具有影响[9]；arnold s研究发现cox5b与雄激素受体相互作用后，cox5b的表达量下降，使多聚谷氨酰胺聚集，从而导致sbma（脊髓延髓肌萎缩症）疾病发生[10]；antonicka h、diaz f、leary sc等人研究发现复合物Ⅳ的组装中间体cox10突变会导致脑白质营养不良及肾小管病，致死性婴儿肥厚性心肌病，sco1突变会导致新生儿肝病，sco2突变会导致婴儿的心肌病，若sco1、sco2同时突变将造成严重的复合物Ⅳ功能缺陷[11]。
线粒体复合物Ⅳ几乎存在于所有的真核生物中，于粮食作物而言，线粒体呼吸链复合物是当前最具前景的农用杀菌剂靶标之一，于动物而言复合物Ⅳ的缺陷会引发许多难以治疗且带有遗传性的疾病，而对于灵芝而言可能会影响灵芝的药理活性、产量、生长速率等。灵芝具有安神药效，降低中枢神经兴奋性，除此还对乙酰胆碱具有拮抗作用，可止咳平喘[12]，灵芝三萜化合物在癌症治疗、抗氧化、降血糖血脂等方面具有很大药用潜能，是良好的药食同源物质[13]，研究复合物Ⅳ缺陷或过表达对灵芝三萜含量的影响，有助于研发高药理活性、高产量、生长速率快的灵芝，对于人类许多疾病的治疗与预防具有重要的作用。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标
（1）筛选线粒体复合物Ⅳ亚基Ⅰ的沉默转化子；
（2）研究复合物Ⅳ亚基Ⅰ缺失对灵芝三萜含量的影响。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
采用分子克隆、rna干扰技术、脂质体转化、rna提取、反转录、实时荧光定量pcr以及紫外分光光度法等。
主要研究方法基本原理：
4. 研究创新点
1.在灵芝中应用脂质体转化筛选COXⅠ的沉默转化子有一定的创新性；
2.线粒体复合物Ⅳ的功能一般与动物病理相挂钩，本次实验通过研究灵芝线粒体复合物Ⅳ的表达情况探究其对灵芝三萜含量的影响。
5. 研究计划与进展
1、2018.9-2018.10
相关理论知识的了解；实验材料和实验试剂的准备；
2、2018.10-2019.4
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