杨树杨生褐盘二孢菌原生质体转化体系的建立开题报告

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1. 研究目的与意义

杨树（poplar）因其自身独特的生物学特性已成为林木基因组学研究的模式物种，是一种主要的人工造林树种，具有较高的经济环保价值。目前我国杨树人工林栽植面积已超过700万公顷，居世界首位，但杨树人工林的林分结构单一，因此容易导致大规模的病虫害暴发流行，丧失其生态、经济和社会价值，造成巨大损失。

杨树黑斑病是其重要病害之一，是由半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目盘二孢属（marrssonina）中的三种病原真菌（杨盘单格孢菌marrssonina populi；杨生褐盘二孢菌marrssonina brunnea；白杨盘二孢菌marssonina castagnei）所引起的[1]，发生范围相当广泛，是影响木材产量和质量的最严重的威胁之一。其中，杨生褐盘二孢菌（m. brunnea）在欧洲、美洲、大洋洲及亚洲几乎所有杨树栽培的地方，不管是黑杨派、白杨派、青杨派杨树等或其杂交种中均有分布，其会在杨树叶表面和背面以及幼嫩的叶柄、茎段上侵染而产生黑色斑点，从而导致杨树叶片的过早脱落，严重削弱了树势，使得植株光合作用效率下降，严重影响杨树生长量，从而使经济效益明显下降[2]{newcombe, 1997 #1}，被认为是杨树黑斑病的主要致病因子。目前生产上对其防治效果很差且费工费时，因此，只有了解病菌致病基因的相关功能及其致病机制，才能对有效控制该病害的方法进行进一步的研究和探索。近年来，随着分子生物学向植物病理学的渗透和发展，真菌的遗传转化也越来越受到重视。目前至少已有100多种丝状真菌实现了遗传转化[3]。peg介导的遗传转化是使用较早较普遍的细胞融合方法，该方法是kao等[4]建立的，此后peg介导的原生质体转化法逐渐延伸至粗糙脉孢菌、构巢曲霉[5]、红曲霉菌等丝状真菌[6]，使这一方法在真菌转化中逐渐被广泛应用。peg介导的原生质体转化能够准确敲除所需目的基因从而研究其基因功能。利用该方法在稻瘟菌、禾谷镰孢菌等病原真菌中进行与信号转导、生长发育、致病等相关基因敲除突变体的研究广为报道，并且取得了重要进展[7-9]。

由此，本课题研究拟将以杨生褐盘二孢菌菌株m6为出发菌株，在研究原生质体制备条件的基础上，旨在构建peg介导的杨生褐盘二孢菌原生质体遗传转化体系，为开展出高效的杨生褐盘二孢菌遗传转化体系、开展该病原菌的功能基因研究及为寻求控制该病害的有效途径奠定基础，进一步从分子水平上揭示病菌的致病机理，从而更好地完善寄主病原物互作的相关分子机制。

2. 国内外研究现状分析

由杨生褐盘二孢菌（marrssonina brunnea）引起的杨树黑斑病已成为杨树上一种重要病害，是国内外杨树苗木及叶片上重要的致病菌，发生范围相当广泛，是影响木材产量和质量的最严重的威胁之一。该病原菌以菌丝体在落叶或1年生枝梢的病斑中越冬，次年春季新产生的分生孢子为初侵染源。分生孢子通过雨水稀释后，随水滴飞溅飘扬传播，分生孢子萌发适宜温度为20-28℃，在水滴中很易萌发。温度适宜、雨水较多的季节，病害发生发展快。雨多、苗圃地潮湿、苗木密度过大、连坐苗木生长不良情况下发病重。

目前国内外对该菌研究主要集中在生物学特性及致病性分化与变异等方面，关于它的分子生物学研究特别是致病机理研究方面较少。用分子生物学手段研究杨生褐盘二孢菌的致病机制以及杨树抗黑斑病机制是防治杨树病虫害的新思路，同时也是一个趋势。迄今国内外只有极少数几篇关于杨生褐盘二孢菌分子生物学研究报道，如张博等[10]利用分子标记对高抗以及高感的杨树品种杂交的群体进行分析，找出了抗黑斑病性状连锁的分子标记。张燕梅等选取病原菌接种后的杨树叶片构建cdna文库，研究不同侵染时间的表达谱，并对杨生褐盘二孢菌诱导的基因进行功能分析和染色体定位。程强等利用race及实时定量技术克隆了两个脂肪氧化酶基因，并进行了表达模式及功能的深入分析[11, 12]。袁坤等对杨树受杨生褐盘二孢菌诱导的蛋白表达变化进行了研究，发现了一批与杨树抗褐斑病相关的蛋白[13]。

在对致病机理研究过程中，利用突变体或同源克隆方法分离与克隆了一些致病相关基因，需要进行基因功能的研究。遗传转化体系是研究病原菌致病相关基因功能的关键技术，是研究病原菌生长发育与致病过程分子机制的有效工具，然而目前国内外还未成功建立对杨生褐盘二孢菌遗传转化体系，特别是peg介导的原生质体转化。peg介导的原生质体转化体系是利用聚乙二醇（polyethylene glycol, peg）作为原生质体的诱导剂，它可使细胞膜之间或外源dna与膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜通透性的改变，从而可以使外源dna进入原生质体，随机插入并整合到染色体上，完成基因置换和互补。由于该方法具有操作相对简便、dna分子易于进入、转化子纯合性好等优点，它已在丝状真菌基因功能研究中发挥着重要作用。因此本研究拟建立杨生褐盘二孢菌原生质体遗传转化体系，为开展该菌致病相关基因克隆和基因功能研究提供一种手段。

3. 研究的基本内容与计划

1.研究内容

本研究首先使用裂解酶（源自木徽菌，trichoderma harzianum）和0.8 m nacl（ph 5.8，作为渗透压稳定剂）处理杨盘二孢菌菌丝，成功分离出其原生质体。随后通过实验确定杨盘二孢菌原生质体在固体tb3培养基上的再生条件及-80℃低温冻存条件。接着参照稻瘟病菌原生质体的遗传转化体系，建立杨盘二孢菌的原生质体遗传转化体系。

2.研究计划

4. 研究创新点

PEG介导的原生质体转化是丝状真菌功能组基因组研究的主要技术方法之一，为了研究侵染杨树的杨生褐盘二孢菌致病的分子机理，本课题研究在对该病原真菌基础生物学特性研究的基础上，参照稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）原生质体遗传转化体系，首次开展进行杨盘二孢菌的原生质体遗传转化体系的探索研究，并进一步将组蛋白增强型绿色荧光蛋白（Histon Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP）成功表达于杨盘二孢菌。