Crispr表达载体功能开题报告

全文总字数：2082字

1. 研究目的与意义

人工改造的CRISPR/Cas9核酸酶系统是目前最有效的基因定点敲除新技术，它可以有效地提高了基因组编辑技术的效率和准确性。CRISPR/Cas9利用DNA双链断裂的非同源末端连接修复机制造成的碱基缺失、插入和置换，实现基因的靶向敲除。该技术的广泛应用使得人类遗传性疾病的治疗，农业发展，以及动植物基因功能的研究等各个领域取得了突破性进展。目前，该技术在木本植物中的研究还相对较少。Zhou（2015）首次利用CRISPR技术对杨树的4CL基因进行了编辑，实现了CRISPR技术在木本植物中的应用，为木本植物基因功能的研究开辟了新途径。本研究计划利用CRIPSR技术探索杨树八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene dehydrogenase, PDS）基因的功能，进一步促进该技术在木本植物功能基因挖掘方面的应用。

2. 国内外研究现状分析

由CRISPR介导的Cas9核酸酶基因编辑体系已成为目前动植物基因组编辑的明星技术。利用CRISPR/Cas9进行定点编辑研究的动物包括斑马鱼，小鼠，线虫，果蝇，罗非鱼等方面，在人类细胞的应用主要是在肿瘤等疾病治疗方面。利用CRISPR/Cas9的特异性，Hsu, P.D.et al和Mali, P. et al两个团队对哺乳动物细胞进行了基因敲除；随后，利用CRISPR/Cas9对斑马鱼和小鼠进行基因编辑的研究也得到报道；利用CRISPR/Cas9 核酸酶技术成功对食蟹猴基因组进行编辑，并培育出个体。这一研究成果解决了长期以来无法进行高效地对灵长类生物基因组进行修饰的难题，为脑科学研究的进一步发展奠定了实践基础。此外，CRISPR/Cas9系统在植物中也得到广泛的应用，主要包括烟草，拟南芥，甜橙，水稻，小麦，玉米，高粱，番茄，二穗短柄草，以及地钱等植物。其中，模式植物水稻和拟南芥已经得到了稳定的突变体植株，朱健康团队利用CRISPR/Cas9系统分别对水稻 ROC5、SPP、YSA基因和拟南芥的BRI1、JAZ1、GAI基因进行了定点编辑。此研究中，水稻拟和拟南芥分别采用其自身启动子(CaMV 35S和OsU6-26、 CaMV 35S和AtU6-26)表达Cas9基因和gRNA，结果表明，CRISPR/Cas9系统可以准确得产生位点特异性双链DNA断裂，并产生较高的突变效率，且在T1代获得了稳定遗传的纯合突变体；Liang等构建了2个不同位点的CRISPR/Cas9载体定点编辑玉米中植酸合成的关键酶基因ZmIPK；Sun等分别用来自拟南芥的AtU6启动子和大豆的GmU6启动子, 构建了CRISPR/Cas9载体定点编辑大豆Gm06g14180、Gm08g02290和Gm12g37050基因；Nature Biotechnology于2015在线发表了利用CRISPR-Cas9系统定点敲除了小麦和水稻两种作物TaMLO和OsPDS等5个基因。

目前为止，CRISPR/Cas9定点编辑技术是唯一在植物中广泛应用的基因组编辑技术。对于研究基因功能，CRISPR/Cas9系统相对其他基因编辑技术处于优势地位。但是，CRISPR技术在植物中的应用大多数体现在草本植物中，在木本植物中相对较少。2015年，Zhou等利用Cas9核酸酶技术定点敲出了杨树4CL基因，实现了CRISPR/Cas9技术在林木中的应用。鉴于该技术在林木上的成功的应用基础，本实验室准备利用CRISPR/Cas9技术进一步在杨树中的应用，以探索更多木本植物功能基因。

3. 研究的基本内容与计划

内容：将构建好的杨树ptpds12和ptpds14基因的crispr载体，通过农杆菌介导的转化方法转入杨树材料，通过pcr验证和转基因植株表型观察，确定阳性植物，并推测基因功能。

计划：

（1）2016.2.22―2016.2.29：阅读文献。熟悉掌握以下概念，基本操作流程，和研究意义： 常用的基因编辑手段及cripsr技术的应用进展；掌握crispr/cas9系统操作原理；杨树转基因的操作。

4. 研究创新点

CRISPR/Cas9技术是当今时代编辑基因组的最好方法，它具有以下优点：1.花费时间少，构建一个CRISPR/Cas系统所花费的时间大大少于使用ZFNs技术和TALENs技术需要的时间；2.载体组装简单便宜，CRISPR/Cas系统的组装只需要20bp左右的引物就可完成；3.具有广泛的靶标位点：只要是目标DNA中具有NGG的PAM序列都可选择；4.在植物的基因编辑中特异性高，尤其是拟南芥中未发现脱靶现象；5.可获得无外源基因的转基因植物；6.可以同时对多个基因进行编辑，而且既可发生点突变，也可编辑大片段。