油茶油脂合成相关基因的克隆开题报告

1. 研究目的与意义

油茶是我国特有的食用木本油料树种，与油棕(elaeisguineensisjacq.)、油橄榄(oleaeuropaeal.)和椰子(cocosnuciferal.)并称为世界四大木本油料树种。油茶适应性广，能耐干旱瘠薄，是我国南方丘陵红壤地区的主要造林和绿化树种。油茶种子中提取的油脂为茶油，富含90%以上的不饱和脂肪酸，不含对人体有害的芥酸和黄曲霉素，其油质优于棕榈油、菜籽油、豆油和花生油，甚至一定程度上优于橄榄油。油茶不仅具有较高的食用价值，还具有较好的药用价值。油茶具有预防心血管硬化、降血压、降血脂等药用功效，还可用作化妆品或原料。

随着人们越来越重视对油茶资源的利用，油茶的种植面积越来越大。提高油茶的产量、抗性及茶油的品质等，是目前乃至－相当长的时间内油茶育种所面临的重要及关键问题。由于油茶自然混交，造成品种混杂，加上世代周期长，使常规育种、尤其是进一步的遗传改良难度加大。而油茶基因组庞大，其分子生物学研究也比较滞后。目前油茶的研究集中在选优、栽培方面，与杨树等树种相比，油茶的基础研究薄弱，油茶的产量、品质、抗逆等性状遗传变异规律有待从群体、个体、细胞、分子水平上系统深入的研究。

本研究在油茶转录组测序结果的基础上，通过序列的生物信息学分析，克隆油茶类黄酮合成和脂肪酸合成相关的基因，对所克隆得到的基因进行组织间(根、茎、叶)，物种间(油茶、短柱茶、浙江红山茶)，种子发育各阶段的qrt-pcr分析，以及原核表达、原生质体瞬时表达、转拟南芥等研究，探索基因表达模式及其调控机制，在种子发育的各个阶段分别取样进行气相色谱分析，了解种子发育过程中脂肪酸含量和组分的变化，为进一步进行油茶重要性状关联分析、油茶品质改良、分子标记辅助育种等研究建立基础。

2. 国内外研究现状分析

cDNA文库构建是研究功能基因组学的基本手段之一，油茶的相关遗传背景不清楚，最直接的方法是先建立cDNA文库，再对目的基因进行筛选和分离，利用RACE技术进行重要基因的克隆。2005年，胡芳名等以湘林1号和湘林4号的近成熟种子为材料，构建了油茶种子油脂转化高峰期的cDNA文库，为与油脂合成有关的关键基因和其他基因的分离克隆与表达分析奠定了基础[58]。随后他们又相继克隆了油茶的酰基载体蛋白(ACP)[59]，硬脂酰-ACP脱饱和酶(SAD)[60]，油茶β-酮脂酰-CoA合酶(KCS)[61]，脂酰基-酰基载体蛋白硫脂酶(FatB)[62]，乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)[63]等基因。这些基因在油脂合成过程中都有着重要的作用：ACP是脂肪酸合成中的关键蛋白质，位于脂肪酸合成酶系的中央，作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应[64]；SAD催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP，其主要作用是将硬脂酸脱氢后形成油酸(18:1)，因而直接决定了不饱和脂肪酸的总含量以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例[65]；彭绍峰等还构建了SAD基因的原核表达体系，进一步验证了SAD的预期功能[66]；FAD基因家族催化油酸脱氢形成亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸，决定了油酸和亚油酸的比例；KCS是在内质网中催化超长链脂肪酸合成的第一步缩合反应的限速酶，对定向调控油料作物的油脂成分具有重要的作用[67]；AACT是催化蛋白酰基化和去酰基化的关键酶；FatB把脂酰-ACP水解为游离脂肪酸和ACP，游离脂肪酸随后转运到细胞基质中，被硫激酶或脂酰-CoA合酶酯化形成脂酰-CoA，然后在内质网上进一步代谢，包括脂肪酸链的延长、脂肪酸链的脱饱和、磷脂和甘油三脂的合成等[68]。

3. 研究的基本内容与计划

本研究拟通过油茶油脂合成相关基因的克隆，进行同源性比较、结构分析及半定量表达分析：

1、设计引物根据油茶转录组测序得到的序列设计引物，要注意引物二聚体及发夹结构的形成情况。并选择合适的退火温度及活化能。

2、基因克隆用race技术进行cdna3端及5端的克隆，并将得到的结果拼接为全长cdna。

4. 研究创新点

1、运用第二代高通量低成本的测序技术替代芯片技术等，有望发现大量与重要性状相关的基因和一些未知基因，海量的信息为今后的相关研究建立了良好的基础。

2、利用色谱技术进行油茶种子脂肪酸积累模式的研究，并与克隆得到的基因的表达量相结合，找出一些油脂合成过程中起关键作用的基因。