美洲黑杨幼苗形成层细胞原生质分离和瞬时转化开题报告

1. 研究目的与意义

美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)生长速度快主要是其次生生长速度比其它树种要快，形成层是次生生长的重要组织，了解形成层的细胞生理生化状态对揭示树木次生生长具有重要的指导意义。分离制备形成层细胞原生质体，通过外源质粒载体瞬间转化，观察外源基因的表达和翻译变化，为探究形成层细胞在次生生长过程提供理想的试验平台。

2. 国内外研究现状分析

1978 年, 靳月华[1]等以小青杨(p.pseudo -simonii)、晚花杨(p.serotina)、健杨(p.robusta)等的嫩叶和花粉愈伤组织为材料进行原生质体解离和融合的初步试验 ,得到杂交原生质体, 但活力低 ,碎片多 。

1986年，ja russell[2]等学者以胡杨populus alba l. x p. grandidentata michx. (nc-5339)叶片原生质体为材料，从非苗期的苗培养物中分离并通过植物再生进行培养。首次报道了用非幼苗来源的叶原生质体再生进行植物再生，并发现，当原生质体衍生的愈伤组织暴露于tdz时，发生了芽再生，并且这种芽可以容易地生根。

1991年，王善平[3]等人利用peg法研究了gus基因（葡糖甘酸酶基因）在毛白杨等几种杨树的叶肉原生质体中的瞬间表达及其影响因素，研究表明结果发现转化后48小时的葡糖 甘酸酶的相对活性大大高于转化后24小时测定的结果，camv355启动子可有效地启动gus基因在所实验的三种杨树中表达。

3. 研究的基本内容与计划

本课题主要研究美洲黒杨的形成层细胞原生质分离和瞬时转化，选取美洲黑杨的茎尖，将茎尖培养的叶片使用果胶酶和纤维素酶混合液酶解过滤获得叶肉原生质体，将原生质体继代培养，制备大量材料用于实验，将原生质体在含有质粒DNA：pABD1的渗透调节和缓冲溶液中电融合或者将需要转化的质粒载体利用PEG方法导入到杨树原生质体中，使其他带有外源重组DNA片段的快速转染，得到转染后的原生质体，通过Southern印迹杂交证明外源基因是否整合到抗性杨树的基因组DNA中，并对转染得到的原生质体进行培养，诱导愈伤组织形成，诱导生根发芽，观察外源基因的表达和翻译变化，做转染细胞的稳定筛选实验来确定外源基因是否稳定转入杨树形成层细胞中。分析美洲黒杨形成层细胞对外源基因的接受情况，进一步研究形成层的次生生长过程。

4. 研究创新点

原生质体是脱去了细胞壁的裸露细胞, 可以对它进行遗传物质的导入和表达 , 易于在控制的条件下进行准确的操作及进行转化体和重组体的分析 , 是一个理想的受体, 是基础理论研究的理想材料。已经由许多研究证明了杨树原生质体瞬时表达系统可以大规模的筛选真菌效应因子并阐述其在宿主细胞内的作用，所以杨树瞬间表达系统的建立，将有助于基因直接导入技术在木本植物中的应用。因此，在本课题中应将杨树原生质体培养和瞬时表达系统的建立作为重点进行研究。