杂交鹅掌楸连续培养条件下的细胞再生能力研究开题报告

全文总字数：2363字

1. 研究目的与意义

植物体细胞胚的概念源于 Haberlandt 1902年提出植物细胞具有全能性,即每一个体细胞都能不断分裂,进而分化形成完整的植株。而体细胞胚胎发生技术自从19世纪 60 年代建立以来，不仅成为植物快速繁殖的最重要的手段之一，而且已发展成为植物胚胎发生机制研究的重要手段。植物体细胞胚胎的不同发生途径或起源方式直接关系到体细胞胚胎发生技术的适用范围，利用细胞生物学手段，研究体细胞胚的发生途径和起源方式不仅有助于理解植物细胞全能性的表达过程，也是发展植物遗传和细胞工程技术的现实需要。

杂交鹅掌楸干形通直、树形美观，淡黄色花朵如郁金香状，具有极高的观赏价值；该树种对氯气和二氧化硫有较强的抗性，广泛应用于园林绿化；同时鹅掌楸属植物木材结构细密、材质轻软、色泽美观，也是一种重要的用材树种。南京林业大学陈金慧等对杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术进行了研究，成功诱导出体细胞胚，建立了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系，但仍有部分问题需进一步改善，即杂交鹅掌楸胚性愈伤组织在连续培养条件下其体胚发生性能会衰退，因此本研究通过选择不同年份以及不同基因型的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织为材料，建立悬浮培养体系后进行体细胞胚的诱导，通过对体胚发生效率以及正常体胚和畸形体胚比例的统计、愈伤组织细胞学观察、内源激素等生理指标的测定，分析连续培养对杂交鹅掌楸体胚发生能力的影响及原因，为杂交鹅掌楸的大规模繁殖提供理论和技术支持。

2. 国内外研究现状分析

植物体细胞胚的概念源于 Haberlandt 1902 年提出植物细胞具有全能性,即每一个细胞都能不断分裂,进而分化形成完整的植株。Steward (1958)和 Reinert(1959)几乎同时发现,组织培养条件下的胡萝卜根细胞产生一种与胚相似的结构,并观察到由这种结构可发育成完整的植株。此后,植物学家对体细胞胚的发生机理进行了广泛的研究,已在100多种植物中得到了体细胞胚胎,并在许多珍稀或重要树种上实现了体细胞工程育苗的产业化。植物体细胞胚胎发生技术不仅成为植物快速繁殖的最重要的手段,而且已发展成为植物胚胎发生机理及遗传转化研究的重要体系。

中国热带农业科学院橡胶研究所进行了大蕉雄花易碎胚性愈伤组织长期继代培养及其植株再生的研究，研究发现，对胚性愈伤组织进行6年的长期继代培养增殖后，愈伤组织可变得松软易碎，且可以维持胚性状态。吉林农业大学研究了继代次数对吉粳愈伤组织生理生化指标及细胞形态的影响，以继代次数为单因素变量，测定吉粳88愈伤组织中可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性、可溶性糖含量以及丙二醛含量，并通过临时装片观察细胞形态。结果表明，随着继代次数的增加，愈伤组织的分化率和再生率呈下降趋势;可溶性蛋白含量基本保持在2.92 mg /g FW左右，无明显变化。MDA含量呈先增加后减少的趋势, POD活性和可溶性糖含量与愈伤分化率极显著相关。细胞形态观察发现，随着继代次数增加愈伤组织逐渐由胚性愈伤转化为非胚性愈伤。西南农业大学研究了长期继代对棉花胚性愈伤组织体胚发生能力及再生植株变异的影响，研究发现植物细胞在离体培养时,再生频率和再生植株的质量与培养时间密切相关。为探讨棉花胚性愈伤组织长期继代的可行性和适宜的继代策略,以川棉 239 胚性愈伤组织为材料,观察其在继代过程中颜色、质地、生长速度和体胚发生能力的变化,体胚及再生植株畸形变异的发生频率。结果表明,通过在MSB KT 0.1 mg/L KNO₃ 1.9 g/L 和 MSB KT 0.1 mg/L IAA 0.1 mg/L 两种培养基上交替培养并结合选择性继代,川棉239体细胞胚胎发生能力虽然可保持较长时间,但随着继代时间的延长,再生能力却逐渐下降,畸形胚发生频率和再生植株不育率逐渐升高，棉花胚性愈伤组织的继代时间不宜超过1.5年。

杂交鹅掌楸的体细胞胚胎发生过程受到多种内外因素的影响，目前已对多种影响因素进行了研究，其影响因素主要有基因型、外植体、生长调节剂配比、光照培养条件、活性炭、液体悬浮培养等。南京林业大学对杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术进行了研究，但仍有部分问题需解决，如缩短体胚诱导周期，提高体胚诱导效率，减少畸形体胚数量等。

3. 研究的基本内容与计划

本研究以基因型163024、14-16025及16-6302杂交鹅掌楸胚性愈伤组织为材料，优化培养基配方及培养条件，利用液体悬浮培养体系诱导体细胞胚。定期对愈伤组织的生长状态（细胞形态，愈伤颜色，颗粒大小，生长速度）和体细胞胚的形成情况（体胚开始出现的时间，体胚发生效率，正常体胚与畸形体胚的比例，体胚苗的形成效率及状态）进行观察、拍照和数据统计，利用石蜡切片对愈伤组织进行细胞学观察，测定连续培养后愈伤组织内源激素等生理指标的变化，详细记录并分析试验数据，分析连续培养对细胞再生能力的影响及原因。

研究计划：

（1）2018年12月~2019年1月：确定选题，查阅资料，拟定杂交鹅掌楸体胚发生材料的准备，基因型的选择，表型观察指标（再生频率，畸形率等）及数据统计的方法。

4. 研究创新点

随着继代培养时间的延长，杂交鹅掌楸体胚发生体系的效率会下降，本研究针对不用年份的试验材料以及每个年份不同的基因型设计出合理的试验方案，结合细胞工程学技术和数理统计方法，揭示连续培养条件对杂交鹅掌楸体胚发生效率的影响及原因。