PCV2型的分离与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题意义 猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv）属于圆环病毒科(circoviridae)的圆环病毒属(circovirus),呈二十面体对称，无囊膜。

病毒粒子直径为17nm，在氯化铯中的浮密度为1.37g/ml,是迄今发现的一种最小的动物病毒，不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。

病毒基因组为单股负链环状dna,全长约1.7kb,有两个大的orfs,其中orf1编码病毒复制蛋白(rep),orf2编码核衣壳蛋白(cap)。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题5.研究目标为进一步研究pcv2b流行毒株的生物学特性及其致病性奠定基础。

6.研究内容将疑似pwms病死的仔猪淋巴结样品匀浆液无菌处理后，接种到无pcv2污染的pk15细胞中，传代培养，经pcr鉴定、全基因组序列测定、荧光定量pcr检测病毒含量，确定分离出可在体外稳定传代的pcv2b毒株。

7.拟解决的关键问题细胞培养得到的第1代病毒按5％同步接种到新消化的细胞悬液中，37℃静置培养3h，弃去上清，pbs洗涤后，加入维持液置于37℃、50%co2培养箱中培养24～48h，按上述方法收取病毒培养物，再同步接种细胞传代。

3. 研究的方法与方案

（1）肝、肺、淋巴结组织样品共计5份，采集自江苏某个猪场的疑似pmws的病死猪。

（2）在无菌环境下，用pbs缓冲液冲洗组织病料后，按1∶10（w/v）加入dmem培养基进行研磨，研磨后的样品反复冻融3次，8000r/min离心5min后取上清，0.22m滤膜过滤后，收获病毒滤液，于－80℃保存。

（3）将病料滤液同步接种于长至70%~80%单层的pk15细胞，37℃吸附1.5h，弃去上清，pbs洗涤后，加入维持液（含2％胎牛血清的dmem）置于37℃50%co2培养箱中培养24～48h，经3次冻融，8000r/min离心5min后取上清，0.22m滤膜过滤后，收获病毒滤液，于－80℃保存。

4. 研究创新点

本试验利用PCR等技术成功从病猪病料中扩增出PCV2b菌株，通过cap基因检测确诊该猪场存在猪圆环病毒2型。结合临床剖检及组织病理学表明分离出的PCV2b菌株可以不同程度的侵害猪各组织器官。本研究结果为了解猪群猪圆环病毒2b菌株的分子流行病学特点提供参考数据。

5. 研究计划与进展

本研究从江苏地区猪场内具有典型PMWS症状的猪体组织中分离的PCV2毒株，经PK15细胞培养扩增，鉴定得到了2株PCV2b毒株，为保证分离株的纯度，本试验借助于序列比对分析软件，并参考相关文献设计了针对PCV2的引物。根据对分离毒株全长基因组测序结果的分析，荧光定量PCR检测病毒绝对含量，确定分离出可在体外稳定传代的PCV2b毒株。