鱼源无乳链球菌前噬菌体Sa04的功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

无乳链球菌（streptococcusagalactice）是革兰氏阳性细菌,属于b族链球菌(group b streptococcus,gbs),是引起我国南方地区罗非鱼链球菌病的主要病原菌之一。它不仅是人类病原菌，对动物也有极大的感染力^[1]。我国是罗非鱼出口大国，2015上半年中国的罗非鱼出口量比2014年上涨了3%。且中国对美国、伊朗、刚果等地的出口量持续增加。然而，我国罗非鱼产业自2009年大规模暴发的无乳链球菌病以来尚无有效控制手段^[2，3]。

温和噬菌体也称溶原性噬菌体，可将其自身基因组整合于宿主菌基因组中，和其宿主菌之间建立起一种稳定的寄生关系，并随细菌基因组进行复制和传代，而不裂解宿主菌^[4]。前噬菌体（prophage）即为整合于宿主菌基因组的温和噬菌体基因组，是细菌间基因水平转移的重要载体，其诱导的基因整合事件可帮助宿主菌获得对自身进化有用的dna 序列，增强其致病性和耐药性，提高宿主菌对生存环境的适应能力，例如使白喉棒状杆菌、食源性希拉肠球菌和分枝杆菌等细菌获得新的毒力基因和耐药基因，对猪链球菌的细菌毒力也有影响^[5-7]，但目前对鱼源无乳链球菌生长、致病性、抗应激能力等方面的影响尚不明确。

本课题以无乳链球菌为研究对象，针对其基因组中存在的前噬菌体sa04开展功能研究，在基因缺失的基础上，研究细菌的生长特性及毒力特性，探讨前噬菌体对无乳链球菌生长、致病性以及环境适应性的影响，为进一步解析该菌致病机制提供理论依据。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标：根据从患病鱼分离出的无乳链球菌基因组构建前噬菌体sa04缺失株，进而通过一系列研究分析野生株及缺失株的生物体内外特性差异，并对前噬菌体在鱼源无乳链球菌致病性方面起到的作用有更深入的了解，进而对预防和控制该型菌株所引起的疾病起到一定作用。

2. 研究内容：(1)前噬菌体sa04基因缺失株的构建 (2)细菌形态的鉴定(3)生物被膜实验 (4)应激试验 (5)溶血活性检验 (6)细胞吞噬试验（7）巨噬细胞的吞噬存活试验（8）黏附及侵袭试验（9）吞噬细胞内环境模拟多重应激试验（10）细胞因子测定

3. 拟解决的问题：对比野生株与前噬菌体缺失株的生物特性的差异，如有明显差异可进一步研究其机理，以期对前噬菌体sa04的致病机制进一步了解，为更有效的预防和控制无乳链球菌的暴发性流行奠定基础。

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法和方案

1.1 前噬菌体sa04缺失株的构建

根据从患病鱼体内提取的无乳链球菌基因组设计前噬菌体sa04基因的上下游引物，扩增目的基因上下游片段，通过融合pcr方法融合扩增上下游同源臂。将上下游同源臂连接至温度敏感型自杀质粒。通过电击转化将自杀性质粒转入菌株中进行同源重组，通过抗性筛选出双交换后的前噬菌体sa04缺失株，并进行常规pcr及荧光定量pcr鉴定。野生株及构建好的缺失株冻存备用。

4. 研究创新点

目前关于鱼源无乳链球菌的前噬菌体功能的研究甚为少见，本研究对其进行生物学特性鉴定可以为其致病机制提供新的见解，为更有效的预防和控制无乳链球菌流行奠定基础。

5. 研究计划与进展

（1）2018.9-2018.11 查阅文献，熟悉实验安全条例及基本操作技术，并进行无乳链球菌前噬菌体基因缺失株的构建；

（2）2018.11-2019.1通过生物被膜、应激试验、吞噬试验等研究分析野生株及缺失株的生物体内外特性差异；

（3）2019.1-2019.5 分析实验结果，必要时重复部分实验，撰写论文。