Ⅰ 型1系鸭肝炎病毒（DHAV-1）实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题意义与前景

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起的常发于雏鸭的高度传染性、致死性的病毒性疾病，临床症状以肝脏的水肿、出血、坏死为典型特征，且动物在死亡时常伴有较为明显的神经症状，如痉挛、头向背部仰，呈现角弓反张的姿势，因而该病也被俗称为“背脖病”。引起该病的鸭肝炎病毒分为三个血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其各自的致病性、临床和病理特性以及流行特点不尽相同。近年来，在我国以及一些周边的国家和地区分离到了一种与传统三个血清型的鸭肝炎病毒无交叉免疫的新型鸭肝炎病毒，其对雏鸭有较高的致死率。雏鸭对鸭肝炎病毒及其易感，日龄越小的雏鸭死亡率越高；随着鸭日龄增加，逐渐获得免疫保护，死亡率会有明显下降，成年鸭几乎呈阴性感染而不发病，但可作为传染源，不断向外界排放病原体。鸭病毒性肝炎的致死率较高，如不对其采取有效的防控措施，将会阻碍我国养殖业的发展，给养殖户及鸭场造成巨大的经济损失，因而需做好预防及鉴别诊断工作，防止鸭病毒性肝炎的大面积爆发流行。对该病原较为传统的检测手段为病原分离和免疫血清学方法，但由于其操作步骤繁琐、耗材及耗时较多且其灵敏性较低，更不用说做到精确定量分析，故利用分子生物学方法建立一种高效、灵敏、特异性强的鸭肝炎病毒检测方法尤为重要。本研究旨在建立该病原的实时荧光定量RT-PCR检测方法，通过各项参数、条件的优化，来提高本方法的特异性、敏感性，更好地用于临床鸭肝炎病毒的检测。

二、研究概况

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，对鸭肝炎病毒的研究不断地深入，已经建立起检测该病毒的分子生物学方法。耿昕颖等建立了PCR-ELISA检测方法，用该方法对50份雏鸭肝提取的RNA样本进行检测，阳性检出率为82%，较RT-PCR检出率高46%。结果表明，该PCR-ELISA方法具有特异、敏感、安全的特点，从而为鸭病毒性肝炎流行病学研究及临床诊断提供了新的途径。其后陆续有学者报道建立了检测鸭肝炎病毒抗原的RT-PCR方法。黄显明等建立了Ⅰ型鸭肝炎病毒的逆转录套式PCR检测方法，该方法具有特异、快速和敏感的特点，可用于鸭病毒性肝炎病毒的快速鉴别诊断。另外，罗玉均等建立了SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测Ⅰ型鸭肝炎病毒，具有较好的特异性、敏感性，为该病原的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。

参考文献

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标

本研究旨在建立鸭肝炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法，通过各项参数、条件的优化，来提高本方法的特异性、敏感性，更好地用于临床鸭肝炎病毒的检测。

3. 研究的方法与方案

一、实验规划

（1）查阅相关文献，找到中国境内流行的鸭肝炎病毒相关的遗传信息及基因进化树等。根据获得的信息，从ncbi数据库中下载已收录的鸭肝炎病毒的核酸序列。

（2）利用计算机软件dnaman进行核酸多序列对比，找到该病原核酸序列中的保守区；再利用primer premier进行引物和探针设计。

4. 研究创新点

目前，对鸭肝炎病毒的检测大多用的是较为传统的病原分离和免疫血清学方法，但由于其操作步骤繁琐、耗材及耗时较多且其灵敏度较低，难以做到精确定量分析，故在临床适用性上仍存在一定的不足。

本研究旨在建立该病原的实时荧光定量RT-PCR检测方法，通过各项参数、条件的优化，来提高本方法的特异性、敏感性，更好地用于临床鸭肝炎病毒的检测。

5. 研究计划与进展

整个研究计划在三个月内分三个阶段完成：

第一阶段（2019.02 - 2019.03）：寒假期间收集、查阅、整理国内外相关的文献资料，对鸭病毒性肝炎有一个初步的了解。

第二阶段（2019.03 - 2019.03）：利用三月的前个半月，进行引物和taqman探针的设计。