酶法提取茶树菇多糖的研究开题报告

1. 研究目的与意义

食用菌是一类营养丰富并有很高食用和药用价值的大型真菌总称，它作为一类高蛋白、低脂肪、营养价值很高的绿色食品日益受到全世界的重视，并成为保健食品的重要功能因子，因此社会对食用菌的研究也越来越深入。食用菌富含多糖、维生素、氨基酸等天然活性成分，其中多糖是一类具有某种特殊生物活性的化合物，具有免疫调节功能、抗肿瘤、延缓衰老、降血糖、抗血栓作用等。

茶树菇（agrocybeaegerita）又叫茶薪菇，杨树菇，柱状田头菇，柳松茸等，属于真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属，民间晒干后用于头晕、头痛、呕吐及小儿低烧、老人气喘等症状的治疗，因此被人们称为“菇中珍品”，享有“中华神菇”，“神仙菇”之称。茶树菇是一种富含多糖的高蛋白﹑低脂肪，矿物质含量相对较高，营养价值很高的食用菌。现代医学研究证明,其可滋阴壮阳，对肾虚、尿频、水肿、癌症、高血压、早衰及小儿低热、尿床等都有较理想的辅助治疗功能。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

（1）对茶树菇多糖的提取工艺进行优化。提取方法采用复合酶法，运用单因素实验和正交实验对提取工艺进行优化；

（2）对茶树菇多糖的抗氧化活性进行研究。可测定茶树菇多糖的dpph自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率等。

3. 研究的方法与步骤

研究方法：

本论文拟运用单因素试验和正交法对酶法提取茶树菇多糖的影响因素和水平进行优化，并测定所得茶树菇多糖提取物的抗氧化活性。

试剂配制

（1）葡萄糖标准液的配制

0.1mg/ml葡萄糖标准液的配制（苯酚硫酸法）：准确称取烘干的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。

1mg/ml葡萄糖标准液的配制（DNS法）：准确称取烘干的分析纯葡萄糖1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）5%苯酚溶液

取苯酚5g用蒸馏水定容至100mL，配成5%苯酚水溶液(置棕色瓶，冰箱冷藏)。

（3）DNS溶液

将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262mL2mol/LNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。

（4）Sevage试剂

氯仿与正丁醇按体积比4:1配制，先量取400mL氯仿，慢慢加入100mL正丁醇，边加边搅拌，混匀后倒入棕色试剂瓶，贮存于冰箱。

（5）三氯甲烷-冰乙酸混合溶液

三氯甲烷和乙酸按2:3（体积比）的比例混匀。

（6）0.075mmol/LDPPH溶液的配制

称取5mgDPPH，溶于167ml甲醇，配成DPPH甲醇溶液。

（7）Tris-HCl缓冲液的配制

0.5mol/LpH8.2的Tris-HCl缓冲液，配制方法：先以少量蒸馏水（300～500mL）溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57g，加入HCl后，将pH调至8.2，最后加蒸馏水至1000mL。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。用时稀释十倍，即为0.05mol/L。

（8）45mmol/L邻苯三酚母液的配制

将42mL浓盐酸定容至500mL作为母液，用时以1:100稀释。准确称取0.568g邻苯三酚于烧杯中，用稀释后的盐酸溶解，并定容至100mL，（烧杯反复冲洗2次，也倒入容量瓶中），摇匀，即得浓度为45mmol/L邻苯三酚母液。倒入棕色试剂瓶，保存在冰箱中。

（9）0.005mmol/mL邻苯三酚的配制

从浓度为45mmol/L的邻苯三酚母液中精确吸取10mL于棕色试剂瓶内，精确加入90mL蒸馏水，摇匀，保存在冰箱中。

（10）9mmol/L水杨酸-乙醇溶液

取1.243g水杨酸溶于1L乙醇溶液中么，即为9mmol/L水杨酸-乙醇溶液。

（11）8.8mmol/LH202

取0.2g30%的过氧化氢溶于200mL蒸馏水中，即为8.8mmol/LH202。 实验步骤：

1.粉碎干燥茶树菇：用FW100型高速万能粉碎机粉碎茶树菇

2.除脂：用索氏提取器以石油醚为有机溶剂使脂类溶于其中后除去

3.控制单因素条件提取多糖：a.温度（35℃.40℃.45℃.50℃.55℃）、b.时间（1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h）c.料液比（1:10，1:20，1:30，1:40，1:50）d.

ph值（3，4，5，6，7）e.酶浓度%（0.00 ，0.08 ，0.16 ，0.24 ，0.32 ）

4.测定多糖含量：

a、苯酚硫酸法测定总糖

原理：可溶性糖主要有能溶于水及乙醇的可溶性单糖和寡聚糖。糖在浓硫酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚所合成一种橙红色化合物，在10~100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490nm波长下有最大吸收峰，因此可用比色法在此波长下测定。苯酚硫酸法可以用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高且不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定时间160min以上。

将灰树花粗多糖提取液稀释100倍，取1ml于试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。然后一起于冰水浴加入5%苯酚水溶液0.5ml，加5ml浓硫酸，混匀，沸水浴5min之后立即取出置于自来水冷却至室温，在最大吸收波长下测定多糖提取液的OD值。将OD值代入标准曲线，算得总糖浓度。

b、DNS法测定还原糖

原理：DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。

将多糖提取液取1ml于试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。分别加入2ml3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂进行反应，在100℃水浴加热5min显色后立即流水冷却，用纯净水稀释至12mL，混匀，测OD值。将OD值带入标准曲线，算得还原糖浓度。

5.通过单因素实验找到的条件进行正交实验6.测定多糖含量

7.验证

8.用提取率最高的条件提取多糖

9.浓缩（用旋转蒸发仪蒸发浓缩）、脱蛋白（Sevag法是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液进行充分振摇,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除,可达到去除的目的）、脱色（过氧化氢脱色）、醇沉（加入乙醇使达不同含醇量，某些成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制）、复溶等步骤精制多糖

10.DPPH自由基的清除：

原理：DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其甲醇溶液呈紫红色，并在波长515nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子数有关，在波长515nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强、吸光度越小。

L-维生素C，又名维生素C，是一种水溶性维生素，具有强抗氧化作用，其对DPPH自由基的清除能力可与多糖溶液进行对比。

槲皮素：又名栎精，槲皮黄素，溶于冰醋酸，几乎不溶于水，具有强抗氧化作用，其对DPPH自由基的清除能力可与多糖溶液进行对比。

步骤：配置不同浓度梯度的茶树菇多糖溶液。然后再分别吸取0.1ml上述不同浓度的多糖溶液，加入0.075mmol/LDPPH甲醇溶液3.9ml，摇匀，放置30min。以甲醇为空白在波长517nm处测定其吸光度值Ai，同时测定3.9mLDPPH甲醇溶液与0.1mL甲醇在波长517nm处的吸光度值Ao。

将维生素C稀释成不同的浓度梯度，进行对照实验。

将槲皮素稀释成不同的浓度梯度，进行对照实验。

清除率计算公式：清除率=(Ao-Ai)／Ao×l00％。

11.超氧阴离子的清除：

采用邻苯三酚自氧化法进行测定。

原理：邻苯三酚在弱碱性（磷酸盐酸缓冲液pH为8.2）条件下，能迅速自氧化，释放出O2-.，生成带色的中间产物，随着反应的进行，O2-.在体系中会不断积累，导致反应液在320nm、325nm及440nm波长的吸光度在反应开始后一段时间之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于上述波长处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率，并与空白液比较便可得出被测物抑制O2-.积累的作用能力。

①测定波长的确定

在紫外可见分光光度计下扫描弱碱性条件下的邻苯三酚溶液（Tris-HCl缓冲液4.5mL，蒸馏水4.2mL，0.005mmol/L邻苯三酚1mL），以去离子水为空白对照。

②邻苯三酚自氧化速率的测定

取4.5mL50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2），4.2mL蒸馏水混匀后在37℃水浴中保温20min，取出后立即加入在37℃水浴预热过的0.005mol/L邻苯三酚1mL，迅速摇匀后倒入比色杯并立刻开始计时，在扫描波长所得的吸收峰下每隔15s测定吸光度，配制空白管用以调零。

③加入待测茶树菇多糖后邻苯三酚自氧化速率的测定

取4.5mL50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2），3.2mL蒸馏水混匀后在37℃水浴中保温20min，按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入1mL不同浓度的茶树菇多糖样本液，蒸馏水相应减少。用样品空白管调零（以消除多糖样品本身颜色的影响）。每隔15s测定吸光度。

④加入不同浓度维生素C后邻苯三酚自氧化速率的测定

取4.5mL50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2），3.2mL蒸馏水混匀后在37℃水浴中保温20min，按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入1mL不同浓度的维生素C溶液，蒸馏水相应减少。用样品空白管调零（以消除多糖样品本身颜色的影响）。每隔15s测定吸光度。

⑤加入不同浓度槲皮素后邻苯三酚自氧化速率的测定

取4.5mL50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2），3.2mL蒸馏水混匀后在37℃水浴中保温20min，按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入1mL不同浓度的槲皮素溶液，蒸馏水相应减少。用样品空白管调零（以消除多糖样品本身颜色的影响）。每隔15s测定吸光度。

根据表5加入相应试剂，以吸光度对时间绘制曲线，在线性范围内计算吸光度的变化速率即邻苯三酚自氧化速率(△A/△t)待测。

清除率按下式计算：

清除率S(%)=(F空-F样)／F空×l00%

式中：F空——空白对照溶液的吸光度随时间的变化率；即(△A/△t)对照，

F样——待测溶液的吸光度随时间的变化率；即(△A/△t)待测

表3超氧阴离子自由基清除活性测定程序

试剂	试剂用量(mL)
空白管	对照管	样品空白管	待测管
Tris-HCl缓冲液	4.5	4.5	4.5	4.5
蒸馏水	4.2	4.2	3.2	3.2
待测样品液	—	—	1.0	1.0
（混匀，37℃水浴20min后继续加入下列试剂）
去离子水	1.0	—	1.0	—
0.005mol/L邻苯三酚	—	1.0	—	1.0
（混匀后，立即计时并测定） 12.羟基自由基的清除

清除原理：用Fenton反应法产生羟基自由基(·OH)，化学反应式如下：

H202 Fe2 →·OH OH- Fe3

以·OH氧化水杨酸产生有色物质，该产物在510nm处有强吸收峰，若体系中加入清除·OH的物质，则会减少有色物质生成，吸光度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

测定过程：取5支具塞试管，并依次编号，每支试管各加入9mmol/LFeS041mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，按试管编号各加入不同浓度的多糖溶液2mL，最后加入8.8mmol/LH2022mL启动反应，于室温下反应1h。用不同浓度的维生素C和槲皮素溶液代替多糖溶液作对照，以蒸馏水代替多糖溶液作空白调零，在510nm处测定样品的吸光度，记录数据。清除自由基活力SA(ScavengingActivity)可用公式表示：

SA=(Ao-As)／Ao×100％（Ao空白对照液的吸光度，As加入提取液后的吸光度）

4. 参考文献

[1]周瑶，毛淑红，孙祺，等.茶树菇多糖提取的复合酶制剂筛选及工艺研究[j].食品研究与开发，2013，34（1）：73-76.

[2]姜宁，刘晓鹏，肖强，等.木瓜蛋白酶酶解辅助提取茶树菇多糖的研究[j].中国酿造，2012，31（1）：119-122.

[3]胡晓倩，唐洪华，程安阳.茶树菇多糖提取及其抗氧化性能的研究[j].湖北农业科学，2011，50(21)：4465-4468.

5. 计划与进度安排

1.1-4周：查阅文献，制定实验方案，撰写开题报告，学习软件使用；

2.5-6周：开始实验准备工作，进行预实验，熟悉实验方法；

3.7-10周：使用复合酶法从茶树菇子实体中提取胞内多糖，利用单因素试验和正交试验确定最佳的提取方法；