剪切型hSkp1蛋白的质粒构建与表达开题报告

1. 研究目的与意义

蛋白质作为一种复杂的有机化合物，是构成细胞的基本物质，是生命活动的主要承担者。可以说没有蛋白质就没有生命的存在。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。而本课题中我们所需要研究的蛋白质Skp1便是人体中上万种蛋白质中的其中之一，Skp1蛋白是一类小分子量蛋白质，其主要的生物学功能在于参与SCF复合体的形成，从而调控生物体内泛素介导的蛋白质降解，并参与多方面的生物发育过程。有研究表明，SKP1蛋白的超量表达能够影响小鼠胚胎的发育，阻断SKP1蛋白的表达，小鼠的受精卵发育得到促进，其后续研究表明，SKP1蛋白被阻断后，会使纺锤体出现异常，例如多级纺锤体、纺锤丝散乱不规则、纺锤体畸变甚至断裂。此外，他们还发现SKP1蛋白被阻断后，小鼠受精卵的染色体在赤道板上排列紊乱的几率提高，也就是说出现染色体变异的几率增高从而导致胚胎的死亡率增高。他们从实验中得到了SKP1蛋白在小鼠胚胎发育过程中起关键作用，并推测哺乳动物中SKP1在激活纺锤体checkpoint通路过程中发挥重要作用。我们将Skp1蛋白基因与PET-22b质粒进行重组表达，并实现Skp1蛋白的提纯，便能使让我们更加直观地去理解了hFOR20蛋白，对其结构域、蛋白序列以及蛋白性质的研究提供了便利。

2. 研究内容和预期目标

本实验属于分子生物学中的基因重组内容，以人类细胞周期调控蛋白skp1为研究对象，对该基因进行体外扩增，将该基因剪切后插入载体中转入大肠杆菌，在大肠杆菌中进行表达的过程。因此该实验包括目标基因的获取以及目标基因的扩增和重组表达，因此具体可以概括为以下几个方面的内容：1.查找文献，确定细胞中所要研究的蛋白序列2.根据蛋白序列和所需要的载体序列设计蛋白质的引物序列3.提取基因组，利用酵母基因组进行目标序列的扩增4.纯化目标序列，将目标序列插入载体中5.将重组的质粒转入到大肠杆菌中进行表达。

预期目标：将人的skp1基因成功转进受体细胞，并能够鉴定检出，在后续进行的质粒抽提和电泳中能够得到我们的目的基因。

3. 研究的方法与步骤

本次蛋白质表达用的是大肠杆菌表达系统。大肠杆菌表达系统是基因工程研究用的最多的原核表达系统。

该系统的优点：a、目前对大肠杆菌的基因表达已经有了很深刻的研究。b、载体和菌株种类齐全。c、表达效率高。d、成本低，易操作。

该系统的缺点：a、可能形成包涵体。b、蛋白质不能糖基化。c、毒素难以去除。

4. 参考文献

1.arquint c, cubizolles f, morand a, schmidt a, nigg ea. theskp1-cullin-f-box e3 ligase βtrcp and cdk2 cooperate to control stil abundance and centriole number.open biol. 2018 feb;8(2).

2.xu x, eletsky a, sheikh mo, prestegard jh, west cm. glycosylation promotes the random coil to helix transition in a region of a protistskp1associated with f-box binding. biochemistry. 2018 feb 6;57(5):511-515.

3.zhou j, wang ys. rational redesign of a cation···π···π stacking at cardiovascular fbw7-skp1complex interface and its application for deriving self-inhibitory peptides to disrupt the complex interaction. j mol model. 2017 sep 26;23(10):296.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-20周~2022-2022-2学期第1周~第2周（2022-12-25~2022-3-16），查阅资料，目的基因序列的确定，准备开题报告，外文论文翻译； （2）第3周~第6周（2022-3-19~4-13），设计引物、选择合适酶切位点、质粒抽提、细胞培养等实验、初步设计；（3）第7周~第11周（2022-4-16~5-18），目标基因扩增、剪切、载体连接、转化、细胞培养、转化子的检测以及重组子的细胞表达等（4）第12周~第14周（2022-5-21~6-8），整理、撰写论文，完成；一张基因扩增电泳检测图、一张质粒酶切电泳检测图，一张重组子构建检测图以及一张蛋白表达电泳图（5）第15周~第16周（2022-6-11~6-19），提交重组子构建的重组细胞、实验报告、英文翻译、图表等，毕业答辩。