灵芝Lac基因的电子克隆与序列优化研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.1研究背景灵芝(ganoderma lucidum.)是一种中药，为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝的主要有效成分有多糖、氨基酸、蛋白质、三萜类、甾醇、生物碱及微量元素等，具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗辐射、抗疲劳等多种生物活性。漆酶(laccase)是一类含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族。它能够氧化酚类和芳香类化合物，并伴随4个电子的转移，将分子氧还原成水。漆酶主要集中于担子菌、子囊菌及半知菌等高等真菌。漆酶具有底物类型的广泛性和对底物的专一性，一般存在于真菌和植物中可以降解酚类及其衍生物、芳胺以及其衍生物、羧酸以及其衍生物、金属有机化合物以及其它非酚类化合物等，使其在纺织、食品、造纸、医药等领域具有广阔的应用。电子克隆基因法是基于表达序列标签（expressed sequencetag, est)和基因组数据库发展起来的新型基因克隆技术，其利用生物信息学知识和计算机技术对est或基因组数据库中序列进行同源性比对分析，pcr扩增整理拼接出新基因的编码序列，并通过rt-pcr进行验证，具有效率高、成本低、对试验条件要求低等特点。序列优化是指为了将目标基因转入宿主中使其高效表达，而对于原有基因密码子序列进行替换，使用宿主偏爱的密码子，使其更加适于在宿主中表达的一种研究方式。因灵芝漆酶十分重要，且灵芝gllac基因在此前未被克隆研究，为了解灵芝gllac基因与植物抗病性的关联，选择拟南芥作为宿主进行表达。使用电子克隆作为研究手段，并对宿主密码子的偏爱性进行分析，替换原有密码子对氨基酸序列进行优化，以便优化在宿主中的表达效率，更进一步了解灵芝gllac基因对于植物抗病作用的研究。1.2研究目的与意义因漆酶(laccase)与植物的抗病性有关，为了在拟南芥中进行异源表达以研究其抗病转基因应用，本研究拟通过电子克隆获得灵芝漆酶（gllac）的完整基因序列，然后按照拟南芥的偏爱密码子对原有的密码子进行替换优化，使灵芝gllac基因在拟南芥中能够高效表达。这对植物的抗病育种研究具有重要意义。

2. 研究内容和预期目标

2.1主要研究内容1.电子克隆灵芝GlLac基因使用电子克隆方式获得灵芝GlLac的完整开放阅读框。（1）使用种子序列中Blastn中得到灵芝GlLac的EST序列。（2）通过DNASTAR软件对EST序列进行拼接延伸，得到最终完整的灵芝漆酶GlLac基因。（3）对于已经得到的灵芝漆酶基因使用Blsatx与Blastp中进行验证，确认拼接结果仍为所需要的灵芝漆酶。（4）拼接结束后，从完整的灵芝漆酶基因中分离开放阅读框，完成对于灵芝GlLac基因的电子克隆步骤。2.电子翻译灵芝GlLac基因及氨基酸序列的优化电子翻译得到灵芝GlLac基因并分析氨基酸序列和密码子使用情况，之后对原有碱基序列进行优化，使用宿主拟南芥偏爱的密码子对于原有密码子进行替换以达到优化的目的。(1) 根据已知的灵芝漆酶ORF序列进行电子翻译，分析原有氨基酸序列的理化性质及密码子使用频率。(2) 对拟南芥的密码子使用频率进行分析，找出拟南芥偏爱的密码子，为在拟南芥中表达灵芝漆酶做好准备。(3) 用已知的拟南芥偏爱密码子替换原有序列中的部分密码子，使其能更好的适应在拟南芥中的表达，提高表达效率。(4) 对优化后的序列进行电子翻译，得到优化后的氨基酸序列及电子翻译结果，分析其理化性质，并将其与原有的翻译结果进行比较，得出优化后的结果，确认此优化方式的合理性。2．2预期目标本研究的目标是：（1）以前期研究获得的灵芝漆酶（Ganoderma lucidum）种子序列为基础，通过电子克隆获得完整的灵芝漆酶GlLAC基因；（2）按照拟南芥偏爱密码子对灵芝漆酶原有密码子进行替换优化，以得到在拟南芥中能高效表达的优化后的灵芝漆酶序列。

3. 研究的方法与步骤

以前期研究获得的灵芝漆酶种子序列为基础，通过电子克隆的方式得到灵芝漆酶GlLAC基因完整开放阅读框（ORF）序列，为在拟南芥中表达该基因进行密码子优化，以便研究漆酶基因对于植物的抗病作用。(1) 灵芝漆酶GILac基因的电子克隆1.以初始种子序列为基础，在Blastn中搜索与之高度同源的灵芝EST序列（一般要求在重叠40个碱基范围内有95%以上同源性，即称为匹配序列）；2.利用DNASTAR软件把这些EST序列拼接在一起，组成重叠群（Contig）；以重叠群为种子序列，再次Blast检索灵芝的EST数据库和序列组装，延伸重叠序列。3.重复上述过程，直到没有新的EST检出即重叠群序列不再延伸，从而生成最终序列，作为种子序列的延伸产物，得到完整的灵芝漆酶GlLAC基因序列。4.通过Blastx验证拼接序列是否编码推测的灵芝漆酶GlLAC；确认无误后，从完整基因序列中分离基因完整开放阅读框（ORF）。(2) 灵芝漆酶GlLAC基因的密码优化1.根据灵芝漆酶GlLAC基因序列，进行电子翻译，获得其序列基本的氨基酸序列，并对原有氨基酸序列进行理化分析。2.分析拟南芥密码子，找到使用频率最高的密码子，根据灵芝漆酶GlLAC的氨基酸序列，利用拟南芥偏爱密码子，进行密码子替换与优化；3.分析使用拟南芥密码子优化以后的序列特征，包括重复结构、AT含量、连续排列等等，进一步进行序列优化。(3) 将优化后的序列进行电子翻译，并与原始蛋白序列进行比较确认方法。将优化后的氨基酸序列进行理化分析，与原有氨基酸序列、密码子使用频率进行比较，得出最终优化后的结果。

4. 参考文献

[1] 李晓宇, 徐文魁, Pat,等. 植物基因组重复序列研究进展[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2019, v.40;No.161(05):12-22.[2] 杨云彭, 马晓焉, 霍毅欣. 密码子优化策略在异源蛋白表达中的应用[J]. 生物工程学报, 2019, Vol.35Issue(12):2227-2237.[3] 张正平, 杨江科, 徐莉,等. 扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达[J].微生物学报, 2010, 50(002):228-235.[4] 乔汉桢. 脂肪酶产生菌的筛选,基因克隆,密码子优化及其高效表达[D]. 华南农业大学, 2017.[5] 刘真英, 李文利.密码子优化后的柞蚕溶菌酶在酵母中的表达及活性测定[J].微生物学通报, 2016, 043(002):292-300.[6] 张晓元, 郝荣华,刘飞,等.密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平[J]. 食品与药品, 2019, 021(001):1-6.[7] 朱龙付. 棉花遗传多样性研究及抗黄萎病相关基因的克隆与分析[D]. 华中农业大学, 2005.[8] 李惠敏, 罗琼, 肖君,等. 沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析[J].生物信息学, 2017, 15(3):149-155.[9] 韩雪清, 刘湘涛, 张永国等. 猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达[J]. 微生物学报, 2003, (5):560-568.[10] Zucchelli E, Pema M, Stornaiuolo A, et al. Codon Optimization Leads to Functional Impairment of RD114-TR Envelope Glycoprotein[J]. 2017:102–114.[11] Hanson G, Coller J. Codon optimality, bias and usage in translation and mRNA decay[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2017, 19(1):20-30.[12] Wang X L , Li X B . Ezike T C , Linus E A , Udeh J , et al. Purification and characterisation of new GlLaccase from Trametes polyzona WRF03[J]. Biotechnology Reports, 2020, 28.

5. 计划与进度安排

5.进度安排

该选题毕业论文相关工作进度按照以下安排进行：

（1）2022年11月30日至2022年12月25日：