基底细胞癌相关的microRNA分子标记物鉴定开题报告

本课题研究的背景

基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）又称基底细胞上皮瘤，由Krompecher首次阐明其分子发病机制，并将其与其他上皮肿瘤进行区分。基底细胞癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，占所有皮肤恶性肿瘤的65%～75%。BBC属于低度恶性肿瘤，局部可呈浸润性生长，转移少见，局部的发病会引起严重的外脑损失及功能丧失。基底细胞癌发病率在全球范围以3%～8%的速度逐年增长，国内男女发病数相似但浅性基底细胞癌以男性多见，主要患者为60～69岁的老年人。基底细胞癌多见于身体暴露部位，尤其是面部。紫外线是诱发基底细胞癌最主要的环境因素，部分皮肤病患者的患病率也较高。

临床治疗基底细胞癌有多种治疗方法，大体可分为手术治愈和非手术治愈两类，其中手术治疗包括破坏性及切除治疗，绝大多数患者采用的是外科切除。临床还可α-2a干扰素进行局部注射免疫疗法治疗。

基底细胞癌在临床诊断中易于恶性黑色素瘤混淆，导致延误治疗或治疗过度。目前对于基底细胞癌的确诊一般需采用活体检查。临床已发现一些基底细胞癌的诊断标记物，如雄激素受体（androgen receptor，AR）、层黏连蛋白 5γ2（Laminin5γ2，Ln5γ2），白细胞分化抗原簇10（cluster of differentiation，CD10）等，然而这些标记物检测方法较为繁琐且特异性不高，确诊仍需配合活体检测，仅能作为诊断的辅助工具。

微小RNA(microRNA)是在动植物体内广泛存在的一类由19-25个核苷酸组成的细胞内源性小型非编码RNA，通过与其靶mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR）区域的互补，可诱导表观遗传修饰和抑制转录、翻译从而实现基因表达的调控，在DNA、mRNA和蛋白质三者之间发挥桥梁作用。迄今为止，人类基因组中已发现超过3000种miRNA。miRNA可调控多达30％的人类基因，越来越多的证据表明，miRNA在生命过程中起着至关重要的作用过程，如增殖、分化、细胞凋亡、细胞信号传导和免疫反应，它们的功能与包括癌症在内的多种人类疾病有关。目前临床上缺乏基底细胞癌的有效诊断标志物，一旦确诊往往已到晚期被且预后不良。组织活检虽诊断准确率高，却侵入性较强。因此，寻找具有高度特异性、灵敏度和准确性的无创miRNA诊断标记物具有重要的意义。

microRNA芯片是常见的基因表达水平检测方法，其原理是将收集到的待测样品中的miRNA中3’端标记上荧光基团再与特定基因芯片上互补的探针杂交，杂交洗涤后可扫描荧光强度，再数据处理后可筛选出表达差异的miRNA，可以将高度富集的通路找出来从而作为特定的标记通路。

多项研究表明肿瘤的发生与发展与miRNA密切相关。超过50％的miRNA位于肿瘤相关基因区域，某些miRNA在肿瘤中的表达可上调或下调，在肿瘤中存在上调的miRNA(致癌基因作用)及下调的miRNA(抑癌基因作用)，进而调控其他基因表达。对比肿瘤细胞与正常组织细胞的miRNA表达水平发现其表达谱具有明显差异，从而筛选出在肿瘤细胞的特异表达的特定miRNA。

Hedgehog和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶的信号调节通路，是基底细胞癌的特定标记通路丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶途径通过激活与DNA合成和有丝分裂有关的转录因子参与细胞增殖，在膜受体（如表皮生长因子受体）激活后，GTP酶触发细胞内激酶偶联，通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶导致转录因子的磷酸化，从而改变细胞周期导致基底细胞癌的产生。

基底上皮细胞中1型胰岛素生长因子受体的信号的激活会导致基底细胞癌的形成，而has-miR-145对其有显著的下调能力，是基底细胞癌分子发病机制中重要的介质。

P53抑癌基因突变是肿瘤常见的缺陷之一 ，50%以上的基底细胞癌都有p53基因突变，p53基因突变是紫外线照射引起的的改变，这些突变代表了细胞内紫外线作用的累积。

目的及意义：

在本课题的研究中，我们将以基底细胞癌microRNA表达谱数据为研究对象，寻找基底细胞癌样本中差异表达的microRNA分子，并对其进行诊断力评价。进一步将microRNA标记物分子调控的靶基因映射到分子通路，力争发现新颖的基底细胞癌相关的分子信号通路，这些通路若经过进一步的实验验证，将为了解基底细胞癌分子机制提供重要的信息。

研究内容：

在本课题的研究中，我们将以基底细胞癌microRNA表达谱的数据做为研究对象，寻找癌症样本中差异表达的microRNA分子，并对其进行诊断力评价。此外，我们还将进一步将microRNA标记物分子调控的靶基因映射到分子通路，并利用cytoscape构建microRNA-mRNA分子调控网络，寻找基底细胞癌中microRNA调控的模块。

(1) miRNA表达芯片数据的收集以及预处理；

(2) 择优采用统计算法选出基底细胞癌中的差异表达microRNA；

(3) microRNA候选分子的优化及其诊断效力评价；

(4) microRNA调控功能模块和通路水平的分析，构建microRNA-mRNA分子调控网络；

(5) 基底细胞癌相关通路的文献检索和机制讨论分析。

预期目标：

通过本课题的研究，我们将力争实现以下研究目标：

1.找到与基底细胞癌密切相关的差异表达microRNA分子及其调控的靶基因，为基底细胞癌的临床诊断提供可靠的分子标记物。

2.在通路水平上研究基底细胞癌相关MicroRNA所调控的分子信号通路，力争发现新颖的基底细胞癌相关的分子信号通路，这些通路若经过进一步的实验验证，将为了解基底细胞癌症分子机制提供重要的信息。

3.构建microRNA-mRNA分子调控网络，找到microRNA在基底细胞癌中调控的核心模块。

方法：

(一)根据论文题目，查阅相关文献。

包括正式出版的中外学术期刊和专著。从中选择10篇以上重点参考文献认真阅读，综合分析，写出文献综述，概括出最新研究进展与存在问题。在上述基础上，完成论文开题报告。

(二)实验研究前期准备工作

根据论文任务计划书，选择研究疾病数据的对象，熟悉Gene Expression Omnibus、Array Express等重要的基因表达数据库，下载一些学习数据进行基因表达分析的练习。根据老师给出的学习资料，自学R编程语言，学会简单的算法和程序。

(三)实验研究工作的实施，具体步骤如下：

1. 检索各大基因表达谱数据库如ArrayExpress（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）和Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，基底细胞癌microRNA表达芯片数据。

2. 整理芯片信息，选取基底细胞癌样本和正常样本进行对照的芯片信息，进行下一步分析。

3. 采用差异基因表达分析软件Limma，分别针对芯片数据寻找出在癌症样本中差异表达的microRNA。

4．通过数据库检索和预测软件寻找疾病中差异表达microRNA所调控的靶基因。

5.将差异表达的受microRNA调控的基因映射到分子通路或分子功能上，例如：KEGG,GSEA,GeneGO,Gene Ontology，将高度富集的通路找出来作为候选的基底细胞癌标记通路。

6. 在Pubmed文献数据库中对候选通路进行文献挖掘分析，寻找之前已有报道的通路，为研究结果提供支撑。同时未经报道的候选通路可能是新发现的基底细胞癌相关通路。

7. 针对新发现的基底细胞癌相关通路，进一步进行文献挖掘，在Pubmed中寻找构成通路的基因在基底细胞癌中的相关文献报道，作为这些通路与基底细胞癌相关的间接证据。

8. 结合文献对基底细胞癌相关基因和通路的生物学机制进行分析和详细讨论。

9.利用Cluster聚类分析和ROC受试者特征曲线评价microRNA作为诊断标记物对疾病样本的预测分类准确性和特异性。

10.利用Cytoscape绘制microRNA-mRNA分子调控网络，寻找基底细胞癌中的显著调控模块。实验过程中要做好原始实验数据的记录。

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