酶法提取云芝多糖工艺的研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：

云芝（coriolus versicolor），又称为彩绒革盖菌、彩纹云芝、杂色云芝、千层蘑、白边黑色云芝等，隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、云芝属或革盖菌属。其子实体具有清热、消炎之功效，临床上用于治疗慢性气管炎、慢性肝炎等疾病。云芝是一种重要的药用真菌，含丰富的多糖、多糖肽、葡聚糖、蛋白质、脂肪、木质素、氨基酸和多种无机盐等物质，其中多糖类物质是云芝中重要的活性成分之一。

云芝多糖（coriolus versicolorpolysaccharides，cvp）可以从云芝子实体中提取，也可以从深层发酵培养的菌丝体及发酵液中分离。研究发现，cvp具有抗肿瘤、抗氧化、免疫增强、治疗肝病、改善学习记忆功能、抗炎镇痛、降血脂以及抗动脉粥样硬化等多种药理作用。有大量研究表明，一大部分从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化作用、抑制亚油酸氧化等抗氧化作用。

2. 研究内容和预期目标

本论文拟运用单因素实验和正交法对生物酶法提取云芝多糖的影响因素和水平进行优化，通过方差分析和直观分析确定最佳的云芝多糖提取条件，并测定所得云芝多糖提取物的抗氧化活性。

研究内容包括：

（1）对云芝多糖的提取工艺进行优化。提取方法采用生物酶法，运用单因素实验和正交实验对提取工艺进行优化，得到最佳的云芝多糖生物酶法提取工艺；

3. 研究的方法与步骤

一、实验研究方法

1、利用单因素实验分析酶浓度、酶处理温度、酶处理时间、料液比、pH等因素对云芝多糖得率的影响，其中包括DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度；

2、利用正交实验，通过方差分析和直观分析，确定最优提取条件并验证；

3、通过浓缩、脱蛋白（Sevage法或三氯乙酸法）、醇沉（乙醇沉淀法）、复溶等步骤精制多糖；

4、测定提取得到的云芝多糖的抗氧化活性，其中包括对DPPH自由基的清除率（DPPH法）、对羟基自由基的清除率（显色剂褪色光度法）、对超氧阴离子自由基的清除率（邻苯三酚自氧化法）。

二、实验步骤

1、准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；

2、配置溶液：

①　1mg/ml葡萄糖标准溶液：使用分析天平称取1g分析纯葡萄糖于锥形瓶中，加入适量的蒸馏水溶解后，置于1000ml的容量瓶中定容，装入试剂瓶置于4℃冰箱中保存待用。

②　0.1mg/ml葡萄糖标准溶液：精确称取0.1g分析纯葡萄糖，加入蒸馏水溶解，置于1000ml容量瓶中定容，装入试剂瓶置于4℃冰箱中保存待用。

③　DNS溶液：甲液：取6.9g重蒸酚溶于15.2ml 10%NaOH，并稀释到69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸钠；乙液：用分析天平准确称取酒石酸钾钠225g于烧杯中，加入300ml 10%的NaOH溶液溶解，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲溶液和乙溶液完全混合之后，既可得到DNS溶液，将其贮存于棕色试剂瓶中，室温下放置一周后使用（注：1% 3,5-二硝基水杨酸溶液的配制，用天平准确称取10g 3,5-二硝基水杨酸于烧杯中，用一定量的蒸馏水溶解，后将溶液转移到1000mL容量瓶中继续加入蒸馏水定容至刻度）。

④　5%的苯酚溶液：用分析天平称取5g苯酚于烧杯中，加入少量的蒸馏水将其溶解，然后将溶液转移至100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，配置完成后转移到棕色试剂瓶中， 4℃冰箱保存备用。

⑤　Sevage试剂：准备正丁醇和氯仿，先取400ml的氯仿于烧杯中，之后再加入100ml的正丁醇，混合均匀之后转移到棕色试剂瓶中， 置于4℃冰箱保存备用。

⑥　0.075mmol/L DPPH溶液：称取5mgDPPH，溶于167mL甲醇，配成DPPH甲醇溶液。

⑦　Tris-HCl缓冲液：0.5mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液，配制方法：先以少量蒸馏水（300～500mL）溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57g，加入HCl后，将pH调至8.2，最后加蒸馏水至1000mL。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。用时稀释十倍，即为0.05mol/L。

⑧　45mmol/L邻苯三酚母液：将42mL浓盐酸定容至500mL作为母液，用时以1:100稀释。准确称取0.568g邻苯三酚于烧杯中，用稀释后的盐酸溶解，并定容至100mL，（烧杯反复冲洗2次，也倒入容量瓶中），摇匀，即得浓度为45mmol/L邻苯三酚母液。倒入棕色试剂瓶，保存在冰箱中。

⑨　0.005mmol/mL邻苯三酚：从浓度为45mmol/L的邻苯三酚母液中精确吸取10mL于棕色试剂瓶内，精确加入90mL蒸馏水，摇匀，保存在冰箱中。

⑩　9mmol/L水杨酸-乙醇溶液：取1.243g水杨酸溶于1L乙醇溶液中么，即为9mmol/L水杨酸-乙醇溶液。

　8.8mmol/L H₂O₂：取0.2g30%的过氧化氢溶于200mL蒸馏水中，即为8.8mmol/L H₂O₂。

3、云芝子实体干燥打粉过筛，加入料液比1比20的石油醚进行脱脂，烘干后装瓶；

4、预实验，练习多糖测定方法和生物酶法，制作还原糖标准曲线和总糖标准曲线；

1)DNS法测还原糖浓度：

取6支干净的试管标号，按照表1的方式分别在试管中先依次加入相应体积的1mg/ml的葡萄糖标准溶液和再加入蒸馏水，然后每个试管中再加入2.0ml 的DNS试剂，100℃水浴5min，颜色变成深黄色之后，立即用流水冲洗。待液体冷却后，加入9ml蒸馏水，充分混匀。调节分光光度计的波长为540nm，将0号试管当作空白对照，测定1-5号试管的吸光度值。以A₅₄₀对葡萄糖浓度(mg/ml)绘制曲线，即得葡萄糖标准曲线。

2)苯酚硫酸法测总糖浓度：

取6支干净的试管标号，按照表2的方式，在试管中，先加入0.1mg/ml不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液，再加入相对应体积的蒸馏水后，将试管放在冰盒中，先加入5%苯酚溶液0.5ml，再加入5.0ml的浓硫酸，混匀，100℃水浴5min。取出试管立即用流水冲洗。液体冷却后，调节分光光度计的波长为490nm，将0号试管当作空白对照，测定1-5号试管的吸光度值。以A₄₉₀的值对葡萄糖浓度(mg/ml)绘制曲线，即得葡萄糖标准曲线。

表1 萄糖标准曲线制作（DNS法）

Tab.1preparation of the standard curve of glucose (DNS Method)

表2葡萄糖标准品的配制（苯酚硫酸法）

Tab.2 preparation of the standard curve of glucose (Phenol-Sulfuric Acid Method)

5、对酶浓度、酶处理温度、酶处理时间、料液比、pH等因素进行单因素实验，计算多糖得率，选出对多糖得率影响最主要的因素以及各因素的主要范围。

l不同酶浓度对云芝多糖提取率的影响

分六个不同的酶浓度，每个做三组平行。

称取脱脂云芝粉末1克置于锥形瓶，按照料液比1:25（g/ml），加入25ml纯水，加入不同浓度的纤维素酶（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），ph为自然纯水ph6.0，温度50℃，水浴加热2h。提取所得粗液进行离心（3500r/ 20min），得上清液。DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度，计算多糖得率。

l不同酶处理温度对云芝多糖提取率的影响

分六个不同的酶处理温度，每个做三组平行。

称取脱脂云芝粉末1克置于锥形瓶，按照料液比1:25（g/ml），加入25ml纯水，加入纤维素酶，ph为自然纯水ph6.0，温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃），水浴加热2h。提取所得粗液进行离心（3500r/min 20min），得上清液。DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度，计算多糖得率。

l不同酶处理时间对云芝多糖提取率的影响

分六个不同的酶处理时间，每个做三组平行。

称取脱脂云芝粉末1克置于锥形瓶，按照料液比1:25（g/ml），加入25ml纯水，加入纤维素酶，ph为自然纯水ph6.0，最适酶处理温度，水浴加热（30min、60min、90min、120min、150min、180min）。提取所得粗液进行离心（3500r/min 20min），得上清液。DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度，计算多糖得率。

l不同料液比对云芝多糖提取率的影响

分六个不同的料液比，每个做三组平行。

称取脱脂云芝粉末1克置于锥形瓶，按照料液比（g/ml）(1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)，加入25ml纯水，加入纤维素酶，ph为自然纯水ph6.0，最适酶处理温度，水浴加热2h。提取所得粗液进行离心（3500r/min 20min），得上清液。DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度，计算多糖得率。

l不同pH对云芝多糖提取率的影响

分六个不同的pH，每个做三组平行。

称取脱脂云芝粉末1克置于锥形瓶，按照最适料液比（g/ml），加入25ml纯水，加入纤维素酶，ph（4.5、5、5.5、6、6.5、7），最适酶处理温度，最适的水浴加热时间。提取所得粗液进行离心（3500r/min 20min），得上清液。DNS法测还原糖浓度，苯酚硫酸法测总糖浓度，计算多糖得率。

6、利用正交实验法，通过方差分析和直观分析，确定最优提取条件并验证；

7、云芝多糖精制

l脱蛋白

将灵芝的提取液收集起来之后，用定性滤纸过滤，并用旋转蒸发仪浓缩至体积变为原来的1/3，计算灵芝多糖质量。多糖质量计算公式如下：

多糖含量（mg/ml）=总糖浓度*稀释倍数-还原糖浓度*稀释倍数

在锥形瓶中加入Sevage试剂，摇晃半小时之后，灵芝多糖中的蛋白质变性，重复此操作过程2次之后使蛋白质完全变性，在5000r/min、4℃的条件下离心15min后，观察现象发现，离心后变性的蛋白质会出现在灵芝提取液与Sevage试剂的分层处，吸取蛋白上方的提取液，再次测定灵芝多糖的含量。

l醇沉

将灵芝多糖提取液脱蛋白后加入三倍体积75%的乙醇溶液，置于4℃冰箱过夜，再以4000r/min、4℃的条件下离心15min后，弃去上清液，取沉淀加入30ml蒸馏水再次溶解后，测定多糖含量，将其余的置于4℃的冰箱保存备用。

l灵芝多糖提取液的浓度梯度制备

将精制后的灵芝提取液加入蒸馏水稀释成三个浓度（2000mg/ml、1000mg/ml、500mg/ml）分装在三个锥形瓶中，置于4℃的冰箱保存备用。

8、测定抗氧化活性，

先配制25mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml三种浓度维生素C溶液保存于试剂瓶中备用（与灵芝多糖抗氧化能力作比较）。

l对DPPH自由基的清除率

取3支干净的试管编号，依次加入0.1ml三种不同浓度的多糖溶液，再加入3.9ml 0.075mmol/l DPPH-甲醇溶液，摇匀室温放置0.5h。调节分光光度计的波长为515nm，以甲醇为空白对照，测定其吸光度值，得A₁值。

取1支干净试管，加入0.1ml甲醇与3.9ml DPPH-甲醇溶液，摇匀室温放置30min。调节分光光度计的波长为515nm，测定在该波长515nm处的吸光度值，得A₀值，并计算清除率。

清除率= [(A0-A1)/A0]×l00％

将上述三种不同浓度的多糖溶液替换为不同浓度的维生素C，按上述步骤进行实验，并计算清除率。

l对羟基自由基的清除率

取3支干净的试管编号，先在试管中加入1ml 9mmol/l的FeS0₄溶液，再加入2ml 的9mmol/l水杨酸-乙醇溶液，再分别加入2ml不同浓度梯度的灵芝多糖溶液，最后加入2ml的8.8mmol/l的过氧化氢溶液，常温放置60min，测其吸光度，得A₁值。

另取1支干净试管按上述步骤加入试剂，将多糖溶液改为为蒸馏水，作为空白对照，调节分光光度计的波长为510nm，测定在该波长510nm处的吸光度值，得A₀值，。

清除率= [(A0-A1)/A0]×100％

将上述三种不同浓度的多糖溶液替换为不同浓度的维生素C，按上述步骤进行实验，并计算清除率。

l对超氧阴离子自由基的清除率。

（1）邻苯三酚自氧化速率

取2支干净的试管，加入4.5ml的50mmol/l Tris-HCl缓冲液到一支试管中，再加入4.2ml蒸馏水，摇晃混匀；另1支加入8.7mL 0.005mol/l的邻苯三酚。将2支试管置于37℃水浴中20min，取出后立即向第一支试管中加入试管2中的样液1ml，混匀均匀后倒入比色皿，立刻开始计时，调节波长为325nm，每隔30s测定一次吸光度，记录数据。

另取1支试管作为空白对照，加入4.5ml的50mmol/l Tris-HCl缓冲液和4.2ml蒸馏水摇晃混匀， 37℃水浴20min，加入1ml去离子水，混匀后立刻倒入比色皿与上述两个比色皿同步计时，并在325nm的波长下每隔30s测定一次吸光度，记录数据。

（2）加入灵芝多糖溶液后邻苯三酚自氧化速率

取3支干净的试管编号，先各加入4.5ml的50mmol/l Tris-HCl缓冲液和3.2ml的蒸馏水充分混匀，再依次加入不同浓度的多糖溶液1ml， 37℃水浴20min，取出后立即向3支试管中加入37℃预热的0.005mol/l邻苯三酚1ml，混匀后倒入比色皿同时立刻开始计时，调节波长为325nm，每隔30s测定一次吸光度，记录数据。

另取3支试管作为空白管，先加入4.5ml的50mmol/l Tris-HCl缓冲液和4.2ml蒸馏水混匀，再加入1ml不同浓度的多糖溶液，置于37℃水浴中20min后，加入1ml去离子水，混匀后立刻倒入比色皿与上述3个比色皿同步计时，并在325nm的波长下每隔30s测定一次吸光度，记录数据。

（3）加入维生素C后邻苯三酚自氧化速率

将上述三种不同浓度的多糖溶液替换为不同浓度的维生素C，按上述步骤进行实验，在325nm的波长下每隔30s测定一次吸光度，记录数据。

根据表3按步骤进行实验，并以A₃₂₀为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线，计算邻苯三酚自氧化速率(ΔA/Δt)。

清除率=[(F0-F1)/F0]×l00%

式中：F₀—对照管中吸光度随时间的变化率

F₁—样品待测管中的吸光度随时间的变化率

表3 超氧阴离子自由基清除活性测定程序

Tab.3Determination of O^2-.scavenging activity

4. 参考文献

[1]孙小文. 云芝多糖提取、纯化、单糖组成分析及体外抗氧化活性的研究[d]. 2014.

[2]王菲菲, 郝利民, 贾士儒, 等. 云芝多糖研究进展[j]. 食品与发酵工业, 2012, 38(6): 148-152.

[3]胡良平. 正交实验设计的意义及其方法和要点[j]. 中国卫生统计, 1989(1):44-46.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17~19周和2022-2022-2学期第1周~第2周（2022.12.24~2022.3.10）：查阅资料，准备开题报告，外文论文翻译，云芝子实体干燥打粉过筛；

（2）第3周~第4周（2022.3.11~3.24）：预实验，练习多糖测定方法和生物酶法，制作标准曲线；

（3）第5周~第7周（2022.3.25~4.14）：对酶浓度、酶处理温度、酶处理时间、料液比、ph等因素进行单因素实验，选出对多糖得率影响最主要的因素以及各因素的主要范围；