剪切型中心体蛋白FOR20的表达纯化研究开题报告

1. 研究目的与意义

微管系统中蛋白for20可以促进微管解聚的动态平衡和细胞迁移，以保证姐妹染色单体正确的均等分离，for20不仅直接与微管结合，而且通过降低微管生长速率、增加解聚速率和突变频率，在体外调控微管动态。如果微管系统发生了异常，那么则会导致发生一些生理异常，甚至疾病（包括肿瘤），所以说，我们应该研究并分析出微管系统中for20的影响，并了解微管系统在细胞周期中的作用及其在正常生理或者病理过程中所扮演的角色。

蛋白for20是一种对纤毛形成和细胞周期进展至关重要的保守蛋白。保守型的中心体蛋白for20对于聚合过渡区和机体对接区有很重要的作用最近，有研究显示中心体的异常也会导致g1期（dna合成前期）的阻滞。但是，目前对于中心体及其结合蛋白在s期（dna合成期)进程中的动能并不清楚。有研究人员发现for20定位于中心体上，下调for20不仅导致细胞周期s期的异常，而且还使得有丝分裂蛋白激酶plk（polo-like kinase 1)与中心体解离。进一步研究表明中心体上的plk1也显著影响s期的进程。但是，plk1的这种作用不依赖于其激活酶活性，也不单独依赖于polo-box结构域的功能，而是依赖于其本身结构的完整性。并且研究进一步显示了外源表达可优先定位于中心体的plk1可以逆转for20下调引起的s期异常。这些实验结果表明中心体蛋白for20可能通过招募plk1定位到中心体，进而保证s期的顺利进行，提示在细胞周期dna复制可能存在一个与plk1功能密切相关的中心体检查点。

本课题以人类中心体蛋白for20为研究对象，对该基因进行体外重组。 体外重组，是指在体外对生物的遗传物质或人工合成的基因进行改造或重新组合形成新核酸分子或新基因的手段。dna体外重组包括目的基因的获取，载体的选择，构建重组dna，重组dna分子导入受体细胞.筛选和鉴定含重组dna的宿主细胞设计点突变引物。

2. 研究内容和预期目标

本实验的内容由以下几个方面构成：

（1）通过文献阅读确定需要研究的蛋白质序列，以及对蛋白质序列进行分析了解该蛋白的二级结构、序列特点以及进化特征等。

（2）设计引物序列

3. 研究的方法与步骤

本实验属于分子生物学中的基因重组内容，以人类中心体蛋白for20为研究对象，对该基因进行体外重组。 体外重组，是指在体外对生物的遗传物质或人工合成的基因进行改造或重新组合形成新核酸分子或新基因的手段。dna体外重组包括目的基因的获取，载体的选择，构建重组dna，重组dna分子导入受体细胞.筛选和鉴定含重组dna的宿主细胞设计点突变引物。

（1）确定蛋白质序列

（2）设计引物序列

4. 参考文献

1. feng s, song y, shen m, xie s, li w, lu y, yang y, ou g, zhou j, wang f, liu w, yan x, liang x, zhou t. microtubule-binding proteinfor20promotes microtubule depolymerization and cell migration. cell discov. 2017 sep 5;3:17032.

2. harmer j, qi x, toniolo g, patel a, shaw h, benson fe, ginger ml, mckean pg. variation in basal body localisation and targeting of trypanosome rp2 andfor20proteins. protist. 2017 aug;168(4):452-466.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-20周~2022-2022-2学期第1周~第2周（2022-12-24~2022-3-8），查阅资料，目的基因序列的确定，准备开题报告，外文论文翻译； （2）第3周~第6周（2022-3-11~4-5），合成基因序列，设计引物，扩增基因，等初步设计；；（3）第7周~第11周（2022-4-8~5-11），目标基因扩增、酶切、连接、剪切、细胞转化、细胞培养、转化子的检测以及重组子等

（4）第12周~第14周（2022-5-13~6-2），整理、撰写论文，完成；一张基因扩增电泳检测图、一张质粒酶切电泳检测图，一张重组子构建检测图以及一张蛋白表达电泳图（5）第15周~第16周（2022-6-3~6-12），提交重组子构建的重组细胞、实验报告、英文翻译、图表等，毕业答辩。