人类FOR20蛋白的定点突变（P105A）研究开题报告

1. 研究目的与意义

细胞周期是细胞生命活动的基本特征之一，在生物的繁殖、发育、生存和遗传等过程中均扮演着及其重要的角色。细胞周期的异常与人类多种疾病相关，其中最重要的就是与肿瘤的关系。微管系统在细胞周期中发挥着至关重要的作用。

微管在许多细胞运动过程中扮演着重要角色,包括细胞分裂和迁移。微管的动力受微管相关蛋白的紧密调控，这些蛋白通过与微管或游离微管蛋白二聚体结合而产生作用。在这里，蛋白for20是一种对纤毛形成和细胞周期进展至关重要的保守蛋白，是一种以前未被描述过的促进微管解聚和促进细胞迁移的蛋白。for20不仅直接与微管结合，而且通过降低微管生长速率、增加解聚速率和突变频率，在体外调控微管动态。在体外微管动力学实验中，for20似乎优先与微管上的游离微管蛋白二聚体相互作用。在海拉细胞中，for20的缺失抑制微管解聚，促进诺科达唑处理后微管的再生。此外，for20最重要的意义是显著抑制哺乳动物细胞的个体和集体迁移。这些数据表明for20和微管相关蛋白功能一样，促进微管解聚和细胞迁移。

最近，有研究显示中心体的异常也会导致g1期（dna合成前期）的阻滞。但是，目前对于中心体及其结合蛋白在s期（dna合成期)进程中的动能并不清楚。有研究人员发现for20定位于中心体上，下调for20不仅导致细胞周期s期的异常，而且还使得有丝分裂蛋白激酶plk（polo-like kinase 1)与中心体解离。进一步研究表明中心体上的plk1也显著影响s期的进程。但是，plk1的这种作用不依赖于其激活酶活性，也不单独依赖于polo-box结构域的功能，而是依赖于其本身结构的完整性。并且研究进一步显示了外源表达可优先定位于中心体的plk1可以逆转for20下调引起的s期异常。这些实验结果表明中心体蛋白for20可能通过招募plk1定位到中心体，进而保证s期的顺利进行，提示在细胞周期dna复制可能存在一个与plk1功能密切相关的中心体检查点。

2. 研究内容和预期目标

本实验的内容由以下几个方面构成：

（1）通过对该蛋白的基因序列进行分析，确定保守氨基酸位点，然后确定突变的氨基酸位置，然后合成蛋白质的基因序列；

（2）针对该突变的氨基酸设计合适的引物序列；

3. 研究的方法与步骤

本实验采用pcr介导的基因突变，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

（1）设计点突变引物

（2）准备模板质粒dna

4. 参考文献

1. feng s,song y, shen m, xie s, li w, lu y, yang y, ou g, zhou j, wang f, liu w, yan x, liang x, zhou t. microtubule-binding protein for20promotes microtubule depolymerization and cell migration. cell discov. 2017 sep 5;3:17032.

2. harmer j, qi x, toniolo g, patel a, shaw h, benson fe, ginger ml, mckean pg. variation in basal body localisation and targeting of trypanosome rp2 and for20proteins. protist. 2017 aug;168(4):452-466.

3. sakane k, nishiguchi m, denda m, yamagchi f, magari m, kanayama n, morishita r, tokumitsu h. identification and characterization of a centrosomal protein, for20as a novel s100a6 target. biochem biophys res commun. 2017 sep 30;491(4):980-985.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-20周~2022-2022-2学期第1周~第2周（2022-12-24~2022-3-8），查阅资料，目的基因序列的确定，准备开题报告，外文论文翻译； （2）第3周~第6周（2022-3-11~4-5），选择突变位点，设计引物，合成基因序列等初步设计；（3）第7周~第11周（2022-4-8~5-11），目标基因扩增、剪切、细胞转化、细胞培养、转化子的检测以及重组子等

（4）第12周~第14周（2022-5-13~6-2），整理、撰写论文，完成；一张基因扩增电泳检测图、一张质粒酶切电泳检测图，一张重组子构建检测图以及一张蛋白表达电泳图（5）第15周~第16周（2022-6-3~6-12），提交重组子构建的重组细胞、实验报告、英文翻译、图表等，毕业答辩。