1. 研究目的与意义
1.1研究背景
木薯(manihot esculenta crantz)属大戟科(euphorbiaceae)木薯属，是全球六大粮食作物，世界三大薯类作物之一。木薯对光、热、水资源的利用率非常高,单位面积的生物能产量几乎高于其它所有栽培作物,具有抗旱、耐瘠薄、适应性广泛、储藏根淀粉含量高(达干重的85%)等特性,在生物质能源的开发和利用中占有非常重要的地位[1]。
但收获后木薯的储藏根不耐储藏，易变质，必须在3d内加工，否则储藏根周边部位出现褐变或青褐变，并且呈现长的筋状，被称之为木薯特有的“采后生理性变质” （post-harvest physiological deterioration，ppd）。这种变质是由酚类等物质氧化引起的，会导致储藏根褐化及腐烂，影响食用及加工性能，给农民及加工企业造成严重的经济损失。
2. 研究内容和预期目标
| 一、研究内容 关键miRNA在木薯块根PPD过程中显示出对目标基因CALS、GRS的调控，在PPD过程中CALS和GRS的表达显示为上调。目前的研究内容为，对这两个基因在木薯中的功能进行分析，验证其表达量的上调，并构建其载体。 （1）分析CALS和GRS基因 首先通过tair（拟南芥基因数据库）查找到拟南芥的CALS和GRS基因的氨基酸序列，用该序列在phytozome（木薯基因库）中调出木薯的基因，选择相似度最高的基因进行分析及实验。 将CALS家族的全部木薯基因，全部拟南芥基因的氨基酸序列进行进化树分析。获得与木薯亲缘最近的已知序列的功能，为下一步CALS基因在木薯块根中的功能分析提供线索。GRS基因同理。 （2）Realtime RT-PCR验证CALS和GRS基因在块根中的表达 选取新鲜木薯块根进行PPD反应，选取不同时间点的木薯块根进行取样并拍照记录。抽提每个时间点的样品的RNA，利用RT-PCR技术获得cDNA，利用Realtime-PCR技术获得每个目标基因的实时定量表达。 （3）构建target gene的表达载体 通过酶切链接载体构建技术，构建CALS和GRS的OE或RNAi表达载体。 二、预期目标 1.验证目标基因在块根中的表达 2.构建miRNA目标基因CALS和GRS的表达载体
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3. 研究的方法与步骤
本课题拟采用的实验方法有两个，即cals和grs的表达分析和载体构建。测定目标基因表达量需要如下6个步骤。
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目标基因的进化树分析
将cals家族全部的拟南芥基因和全部的木薯基因，其氨基酸序列，导入mega软件中，进行比对并保存。将比对结果继续在mega中进行进化树分析，以获取已知的亲缘关系较近的基因，参考其功能。
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[1] fahlgren n, howell m d, kasschau k d, et al. high-throughput sequencing of arabidopsis micrornas: evidence for frequent birth and death of mirna genes[j]. plos one, 2007, 2(2):e219.
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（1）2022年12月11日至2022年12月22日：与指导老师见面，确定论文选题；
（2）2022年12月25日至2022年3月16日（第1周~第2周）：接受毕业论文任务书；查阅文献资料，撰写开题报告，完成开题；外文论文翻译；
（3）2022年3月19日至2022年4月13日（第3周~第6周）：熟悉相关分子生物学实验方法与数据分析方法；完成预实验，及时调整实验方案，优化分析方法；
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