体外双酶一锅法制备D-核酮糖开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：

稀有糖是在自然界中存在的，据估计，自然界中约有50种稀有糖；但其是含量极少的一类单糖及其衍生物，据估计，一般具有低热量、低吸收等特点。随着生活水平的提高，人们对保健食品和养生的追求也越来越高，传统高能量甜味剂如蔗糖等有被低热量、功能性糖取代的趋势。近年来，稀有糖已成为研究的热点。传统研究稀有糖的生产主要包括生物法和化学法。化学合成法存在着反应步骤多、需保护和脱保护、条件苛刻、产率较低和副产物多等不足，还需要改进和完善。因而探索生物法制备高价值稀有糖越来越受到广大研究人员的重视。生物法主要是利用微生物或者相关的酶将底物糖转化为稀有糖。并且因为生物法反应条件温和、反应过程容易、对环境友好等优点在国际上受到了广泛的关注。因此，鉴于其温和的反应条件、高效率和立体选择性以及环保特性，一锅多酶法逐渐成为该领域的主流。

在生物催化或有机合成中应用广泛，多酶级联反应具有缩短反应时间、降低成本、减少不稳定中间产物和副产物的积累等众多优点倍受关注。一锅多酶法的反应与传统的多步合成反应相比，操作步聚简便，不需要对反应中间体进行分离与提纯，降低反应成本，减少环境污染，提高合成效率，是未来发展的方向。

2. 研究内容和预期目标

主要研究内容：

1. osrpib双突变体和pcdte工程菌株构建。
2. 诱导工程菌株产酶，并且从菌株中提取osrpib和pcdte并且纯化。
3. 双酶特异性，动力学研究（最适温度，最适ph，半衰期等），确定多酶级联反应条件。
4. 双酶比例优化，做最大转化率，制备d-核酮糖，并与两步法进行比较。

本实验可能需要的实验仪器有：摇床、台式离心机、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、分析天平、高效液相色谱仪、ph计、4℃电冰箱，恒温水浴摇床，示差检测器等。

预期目标：完成体外双酶一锅法制备d-核酮糖的论文。

3. 研究的方法与步骤

本课题拟采用的研究方法、步骤：

1.工程菌的培养：将重组菌株 b 接种于 lb 液体培养基（卡纳抗性）中 37 ℃， 200 r/min 中培养至 od600 为 0.6 左右时，加入 0.1 mm iptg 后再在16 ℃下诱导 20 h 后，收集菌液。

2.超声破碎法提取酶：将收集的菌液离心 10 min，8000 r/min，用磷酸缓冲液（ph 7.4 左右）洗涤三次后，再用磷酸缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎 10 min，超声破碎的条件：超声 2 s，间隙 3 s，总时间 15 min，功率 40 % 。低温离心（10000r/min，30 min，4 ℃）以保持酶的活性，去除菌体细胞沉淀、收集离心后的上清液用于蛋白纯化。

4. 参考文献

主要参考文献：

[1] ishida y , kamiya t , itoh h , et al. cloning and characterization of the d-tagatose 3-epimerase gene from pseudomonas cichorii st24[j]. journal of fermentation bioengineering, 1997, 83(6):529-534.

[2] chuaboon l , wongnate t , punthong p , et al. one-pot bioconversion of l-arabinose to l-ribulose in an enzymatic cascade[j]. angewandte chemie, 2019.

5. 计划与进度安排

本课题的具体进度安排：

1. 2022-3-6～2022-3-20：查阅文献资料撰写开题报告并完成英文翻译;

2. 2022-3-20～2022-3-31：osrpib双突变体和pcdte工程菌株构建及甘油管保存;

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