1. 研究目的与意义
研究背景
锰污染是随着现代工业的发展逐渐引起人们重视的的一类化学污染。生产染料、油漆、塑料、农药等的工厂及锰的采矿场和冶炼厂是锰的主要污染源来源,并造成环境中锰含量的显著增加。水体中锰元素含量超标会引起水生生物急性中毒,锰还会以食物链富集的方式进入人体内,并对人体健康产生危害。因此治理锰污染便显得尤为重要,迫在眉睫。传统的修复方法像植物修复、污染物化学浸出法、毒性金属耐受性细菌的生物修复法等费用昂贵且不能长期有效,其他方法虽效果很快但却成本高昂并且会摧毁土壤的生产力或对水环境易造成二次污染等。微生物诱导碳酸盐沉淀(micp)是解决该问题的一种新型、对环境友好的绿色方法。本文考察了巴氏芽孢杆菌对锰离子的耐受性及其诱导的锰沉淀过程,以期该方法可以更好地应用于废水中重金属锰的处理。
研究目的
2. 研究内容和预期目标
研究内容
在实验室前期对巴氏芽孢杆菌不断研究的基础上,提前准备好接种所需的巴氏芽孢杆菌平板并接种在三个空白的nb-urea培养基上生长至有明显的单菌落出现。利用移液枪将单菌落打入5ml试管培养基中14h摇床培养。准备11组(每组3个)试管并且提前配置好相同浓度的锰离子溶液。重选菌液后固定好od值后接种统一摇床培养。并测量(0,8,12,16,20,24,32,36,40,44,48,56,60,64,68,72h)时的od600值。完成后再换不同浓度的锰离子进行实验。以探究不同浓度锰离子对巴氏芽孢杆菌生长参数的影响。同时收集菌液进行涂布平板,在含不同锰金属浓度的平板上计数单菌落数。拍摄重金属的矿化照片。
预期目标
3. 研究的方法与步骤
研究方法
通过测量不同锰离子浓度下巴氏芽孢杆菌的生长曲线变化得到最低抑菌浓度,并观察锰沉淀的形态特征。最后汇总实验结果各项数据通过Excel对整理好的实验数据进行显著性分析。
实验步骤
一、S.P(巴氏芽孢杆菌)曲线的测定
将冰箱中提前准备好的S.P冻存液取出,用枪头沾取少量细菌冻存液均匀划线接种到YE-urea固体平板上,恒温培养箱30℃培养24小时。待固体平板上出现有明显的S.P单菌落后准备接种。挑取个头适宜的单菌落加入两个5mL NB-urea液体培养基的试管中,恒温震荡培养箱中培养(30℃,180rmp)14小时。取6ml菌液离心(6000rmp,5min)后吸去上清液,加入3mlNB-urea液体培养基继续浓缩混匀,测其OD600并调至1左右。将校正调1后的菌液分别取50ul加入装有5 mL NB-urea液体培养基的试管中,置于恒温震荡培养箱中培(30℃,180rmp)48h并且每隔2h测量试管内菌液的OD600,平做行试验3组。(0,2,4,6,8,10,12,14,16,24,28,32,36,48h)
二、S.P对重金属的耐受性试验
(一)数据测定
1. 生长曲线
制备1M的MnCl2溶液,按下表设置重金属浓度梯度(5,10,15,20,25mM)
| 5mM | 10mM | 15mM | 20mM | 25mM |
MnCl2体积 | 25ul | 50ul | 75ul | 100ul | 125ul |
NB-urea体积 | 4975ul | 4950ul | 4925ul | 4900ul | 4875ul |
其他步骤同(一、S.P生长曲线步骤),每4h测一次OD600 (0,8,12,16,20,24,32,36,40,44,48,56,60,64,68,72h)
2. pH测定
每隔4h测菌液OD600值后,用pH仪精确测量菌液pH值。
3. 活菌数的测定
平板菌落计数法:提前设置重金属浓度梯度(5,10,15,20,25mM的Mn)加到固体培养基里,将稀释10n倍的菌液按10μL定量滴至固体NB-urea培养基上,并用涂布棒涂布均匀,然后置于恒温培养箱内,30℃的温度下培养24 h。记录培养基上数目范围在3~100的单菌落数。根据稀释倍数和取样体积计算每个样品最终的活菌数,单位为CFU/mL,做3组平行试验。
4、拍摄重金属矿化的显微照片
每次测完OD值后用油镜观察锰的沉淀形态变化,并拍照片记录保存。
三、分析处理实验数据
绘制巴氏芽孢杆菌生长曲线图、以及巴氏芽孢杆菌在锰离子不同浓度下的生长曲线图、72h内的pH变化折线图、活菌数变化折线图并最终筛选出最低抑菌浓度。观察锰沉淀形态变化;撰写论文并答辩。
4. 参考文献
[1] zhang w, ju y, zong y, qi h, zhao k. in situ real-time study ondynamics of microbially induced calcium carbonate precipitation at asingle-cell level[j]. environmental science and technology, 2018, 52(16):9266-9276.
[2] bal b, ghosh s, das ap. microbial recovery and recycling ofmanganese waste and their future application: a review[j]. geomicrobiologyjournal, 2019, 36(1): 85-96.
[3] 陈江博, 朱云乐, 梁志, 刘朝琴, 黄康, 朱仁秀. 锰在环境中的分布, 迁移及转化研究进展[j]. 内江科技, 2019, (4): 40.
5. 计划与进度安排
①、2022年1月1日~2022年1月12日 查阅文献,确定课题内容框架;学习巴氏芽孢杆菌培养的基本操作。
②、2022年3月1日-2022年3月14日 调研大量文献,完成开题报告。设计实验方案并完成预实验。
③、2022年3月15日-2022年5月20日 考察锰离子浓度对巴氏芽孢杆菌的毒性影响及该菌诱导锰沉淀的动力学研究分析;对所得产物进行形貌和成分表征;对生长曲线等数据进行处理并画图;完成论文主体内容的撰写。
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