土壤高产普鲁兰酶产生菌的筛选及初步鉴定开题报告

1. 研究目的与意义

普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，又称茁霉多糖酶（pulluanase），能够通过切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉，从而专一性水解普鲁兰糖（pullulan）。

与异淀粉酶不同，普鲁兰酶能够将最小单位地支链分解，最大程度上利用淀粉原料。

依据普鲁兰酶的底物特异性可以分为两大类：Ⅰ型普鲁兰酶（ec3.2.1.41）又称脱支酶，能够特异性水解普鲁兰糖和α-1，6糖苷键。

2. 研究内容和预期目标

1. 土壤普鲁兰酶产生菌的筛选 2. 土壤普鲁兰酶产生菌的初步鉴定

3. 研究的方法与步骤

1、实验材料 1.1主要试剂 酒石酸钾钠、去离子水、3, 5二硝基水杨酸、氢氧化钠、苯酚、na2so4·7h2o、碘、碘化钾、普鲁兰糖、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液 1.2主要材料 土壤样品、糯米淀粉、蛋白胨、酵母膏、kh2po4 、k2hpo4 、mgso4·7h2o 、琼脂、红色普鲁兰糖、牛肉膏、玉米淀粉 1.3主要试剂配制（1）dns试剂：称取酒石酸钾钠122.1674 g，放入400 ml去离子水中，加热溶解，加入3, 5二硝基水杨酸3.15 g，继续加热溶解后加入氢氧化钠10.5g，加热溶解，加入苯酚2.5 g，加热溶解加入na2so4·7h2o 4.9972 g(期间加热温度控制在60℃以内)，冷却，用去离子水定溶至500 ml，贮于棕色瓶中避光保存，放置2周后使用。（2）碘试剂：称取2.2 g碘、4.4 g碘化钾，用去离子水将其完全溶解后定溶至100 ml，贮于棕色瓶中避光保存。（3）普鲁兰糖溶液(0.5%)：称取普鲁兰糖0.50 g，加入90 ml去离子水，充分溶解后定容至100 ml。（4）磷酸缓冲溶液(ph6.0、0.2 m磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)：将配制好的0.2 m磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液以12.3：87.7比例混合。 1.4培养基配制（1）分离培养基：糯米淀粉25.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，kh2po4 0.5 g，k2hpo4 0.5 g，mgso4·7h2o 0.1 g，琼脂25.0 g，加水定容至1000 ml，ph6.0。（2）鉴别培养基：nacl 2.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨10.0 g，红色普鲁兰糖3.0 g，琼脂25.0 g，ph7.0。（3）保藏培养基：同分离培养基成分；（4）种子培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，nacl 5.0 g，加水定容至1000 ml，ph6.0。（5）发酵培养基：玉米淀粉20.0 g，酵母膏10.0 g，kh2po4 1.0 g，mgso4·7h2o 0.5 g，feso4 0.01 g，加水定溶至1000 ml，ph6.0。 培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20 min。 2、分离方法 2.1土样预处理 将采集的各种土壤样品用无菌塑料袋或小瓶封存，编号，于4℃条件下保存。 2.2初筛 称取5 g土样于45 ml生理盐水中，加入玻璃珠，充分震荡、静置1 h；取10 ml上清，做梯度稀释，选择合适稀释度涂平板，30℃培养48 h；在分离平板中滴加适量1%的碘液，挑取有透明圈的菌株进行划线分离纯化，30℃培养24 h；把具有透明圈的菌株接种到鉴别培养基中，温箱中培养48 h，将在添加有红色普鲁兰糖平板上能产生透明圈的菌株挑选出，纯化两次。 2.3 复筛 将初筛得到的菌种，挑取少量，接种于装有20 ml种子培养基的三角瓶中，30 ℃培养16 h。再将种子培养基倒入装有40 ml发酵培养基的三角瓶中，于回转式恒温调速摇瓶柜中200 r/min进行好氧发酵,30℃发酵48 h。 3、酶活力测定 取发酵液，5000 r/min离心10 min，得到上清酶液，在洁净试管中加入1 ml 0.5%普鲁兰糖溶液、1 ml ph6.0的磷酸缓冲液，60℃水浴加热5 min，加入1 ml酶液，60℃保温30 min；加入1.5 ml dns试剂，沸水浴5 min，显色，流水冷却。520 nm测定od值。对照组为煮沸 10 min 灭活处理后的酶液。 4、酶学性质测定 4.1 温度对酶活力的影响及温度稳定性 将适当稀释后的酶液与底物分别置于 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下反应 30 min，测定重组普鲁兰酶的酶活力，以酶活力最高者为 100%对照，以探究该重组普鲁兰酶的最适反应温度。将粗酶液分别置于 35、40、45、50 ℃条件下保温 15、30、45、60、75、90、105、120 min，然后加入到底物中置于最适温度下反应 30 min，测定其剩余酶活力，以未保温处理的粗酶液的酶活作为 100%对照，探究该普鲁兰酶在不同温度下的稳定性。 4.2 ph 对酶活力的影响及ph稳定性 在最适反应温度下，将适当稀释后的酶液分别与ph 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 缓冲液配置而成的1%普鲁兰糖反应 30 min，测定相应的酶活力，以酶活力最高者为 100%对照，研究该酶的最适作用 ph。将粗酶液分别置于 ph 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 缓冲液中室温保存 1 h 后，于最适温度和最适 ph 下反应，测定其剩余酶活力，以未作处理的酶液的酶活力作为对照，探究该普鲁兰酶在不同ph下的稳定性。 5、鉴定 5.1初步鉴定 使用半自动细菌鉴定仪。 5.2 16s rdna分析 将得到的菌种接种于种子培养基中，摇床180 r/min、37℃培养12 h；获取菌液，进行16s rdna pcr基因扩增。

16s rdna pcr引物：its1（5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′）、

its4（5′-tcctccgcttattgatatgc-3′）

pcr扩增体系（20μl）： 10×ex taq pcr buffer 2μl dntp（10mmol/l） 1.6μl its1 1μl ts4 1μl dna模板 1μl ex taq dna聚合酶 0.2μl 超纯水 13.2μl扩增程序： 94℃（预变性） 5 min 94℃（变性） 45 s 50℃（退火） 45 s 72℃（延伸） 100 s （循环32次） 72℃（最终延伸） 7 min

目的片段长度约为1.5 kb，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒进行胶回收，pcr扩增产物经纯化后，用abi prismtm377xl dna sequencer进行测序。

4. 参考文献

[1]朱金峰,孙会忠,王小东,宋月芹,孙明辉,陈冲,陈启龙.烤烟根际土壤产普鲁兰酶菌株的分离鉴定及产酶活性[j].湖北农业科学,2016,55(15):3856-3859.

[2]高涛. 产耐热普鲁兰酶菌株的筛选、发酵条件优化及其诱变选育[d].南京农业大学,2017.

[3] 唐宝英. 耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选及发酵条件的研究[j]. 微生物学通报, 2001, 28(1):39-43.

5. 计划与进度安排

1、2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期1-2周（2022-12-28~2022-3-14），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；

2、第3周~第5周（2022-3-15～2022-4-4），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。

3、第6周~第7周（2022-4-5～2022-4-18），预实验