菊苣假单胞菌D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达及特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

背景

d-塔格糖-3-差向异构酶(d-tagatose 3-epimerase,缩写为dte)家族，是催化酮糖类单糖c-3位置差向异构化反应的一类酶，也是稀有糖生产中的核心酶。dte家族可以催化d-果糖与d-阿洛酮糖、d-山梨糖与d-塔格糖、l-阿洛酮糖与l-酮糖、l-塔格糖与l-山梨糖等之间的生物转化反应，在稀有糖生物转化中占有重要地位。随着稀有糖在食品，保健品，医药中间体等领域的广泛应用，利用dte家族制备稀有糖备受关注。在稀有糖的生物催化过程中，可以利用丰富的自然资源，如淀粉、乳清和木材等，作为稀有糖生产的起始原料。比如从淀粉中可以获得大量的d-葡萄糖；从乳清中可以获得乳糖，乳糖水解后可以产生d-葡萄糖和d-半乳糖；从木材的半纤维质中可以获得d-木糖。因此利用廉价单糖为原料，通过差向异构酶的生物转化反应来制备稀有糖已经成为研究的热点。

2. 研究的基本内容和问题

研究内容

稀少糖能用于制备抗病毒药物，具有很多良好的功能，酶法生产稀少糖备受国内外研究者的关注。本课题针对稀少糖制备问题，以菊苣假单胞菌（pseudomonas cichoriist-24）d-塔格糖-3-差向异构酶（pcdte）为蛋白酶，对pcdte进行克隆表达以及酶的特性研究。具体研究内容如下：

1）pcdte工程菌株构建。

3. 研究的方法与方案

研究方法、步骤

（1）工程菌的培养：将重组菌株接种于 lb 液体培养基（卡纳抗性）中 37 ℃， 200 r/min 中培养至 od600 为 0.6 左右时，加入 0.1 mm iptg 后再在16 ℃下诱导 20 h 后，收集菌液。

（2）超声破碎法提取pcdte酶：将收集的菌液离心 10 min，8000 r/min，用磷酸缓冲液（ph 7.4 左右）洗涤三次后，再用磷酸缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎 10 min，超声破碎的条件：超声 2 s，间隙 3 s，总时间 15 min，功率 40 % 。低温离心（10000r/min，30 min，4 ℃）以保持酶的活性，去除菌体细胞沉淀、收集离心后的上清液用于蛋白纯化。

4. 研究创新点

参考文献

[1] ishida y ,kamiya t , itoh h , et al. cloning and characterization of the d-tagatose3-epimerase gene from pseudomonas cichorii st24[j]. journal of fermentation bioengineering, 1997, 83(6):529-534.

[2] 邢庆超, 沐万孟, 江波,等. clostridiumscindens atcc35704中的d-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达,纯化及活性研究cloning,expression,purificationand characterization of d-tagatose-3-epimerase from clostridium scindens atcc35704[j]. 食品与发酵工业, 2011,037(008):6-10.

5. 研究计划与进展

进度安排

1）2021-3-6～2021-3-20：查阅文献资料撰写开题报告并完成英文翻译;

2）2021-3-20～2021-3-31：pcdte工程菌株构建及甘油管保存;