热水浸提法提取金针菇多糖工艺的优化开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景

金针菇（flammulinavelutipes）学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属，是著名的食、药兼用真菌，不仅味道鲜美营养价值高，是消费量较大的食用菌类之一；而且含有多种生物活性物质，是较好的保健食品。金针菇的国内外市场日益广阔，目前国内人工栽培较为广泛、金针菇人工栽培技术并不复杂，只要能控制好环境条件，就容易获得稳定可靠的产量。

研究发现，金针菇中含有丰富的多糖类物质。多糖是由单糖连接而成的多聚物，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中。生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖三大类。金针菇中的多糖是其主要的活性成分之一，具有提高人体免疫力、保肝、保湿、抗感染、抗氧化、辅助改善记忆和缓解疲劳等保健作用。例如，严茂祥、陈芝芸、项柏康等人在金针菇多糖对小鼠移植性肿瘤抗瘤效应研究中，把多糖注入到小鼠的腹腔中，多糖引发脾脏的淋巴细胞增值并且导致血管扩张和出血反应，这充分反映了金针菇多糖的免疫调节功能。金针菇中主要的有效生物活性成分金针菇多糖,由于具有抑制肿瘤、抗癌和增强机体免疫力等作用而被广泛受到重视。1968年，日本kamasuka等人率先报道了它对小鼠肉瘤s-180有明显的抑制作用。从此之后，金针菇多糖的抗癌功效引起了众多学者们的广泛关注。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

（1）利用单因素实验确定最佳的提取次数，利用plackett－burman设计考察浸提温度、浸提时间、料液比、ph等因素对多糖提取率的影响，通过模型分析找寻较重要因素。

（2）利用爬陡坡试验，以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据因素效应值大小确定变化步长，快速逼近最优区域。

3. 研究的方法与步骤

实验方法及步骤：

1.实验前期准备工作：

（1）根据论文任务书，查阅文献，制定具体的实验方案；

（2）准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；

（3）将购买的金针菇磨成粉状备用；

（4）学习使用Design-expert软件，进行Plackett－Burman和Box－Behnken设计，并对结果进行分析；

（5）进行预实验，学习并熟练热水浸提法提取金针菇多糖的方法。

2.实验研究工作的实施：

（1）实验流程：

金针菇磨成粉状→预实验以及制定标准曲线→次数的单因素试验→PB试验得最显著因素→最陡爬坡实验逼近优化区域→响应曲面实验得中心点→实验验证最佳提取条件

（2）溶液的配制

1）葡萄糖标准液的配制

0.1mg/ml葡萄糖标准液的配制（苯酚硫酸法）：准确称取烘干的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。

1mg/ml葡萄糖标准液的配制（DNS法）：准确称取烘干的分析纯葡萄糖1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。

2）5%苯酚溶液

取苯酚5g用蒸馏水定容至100mL，配成5%苯酚水溶液(置棕色瓶，冰箱冷藏)。

3）DNS溶液

将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262mL2mol/LNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。

（3）苯酚硫酸法的标准曲线以及总糖的测定

葡萄糖标准曲线的制备（苯酚硫酸法）：按表1分别加入浓度0.1mg/ml的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作（苯酚硫酸法）

Tab1productofstandardcurveofglucose(Phenol-SulfuricAcidMethod)

按上表完成步骤后，每管中冰水浴加入5%苯酚水溶液0.5ml，加5ml浓硫酸，混匀，沸水浴5min，冷水浴冷却。在最大吸收波长下，以0号试管为空白对照，测出1～5号管的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

将金针菇粗多糖提取液稀释100倍，取1ml于试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。然后一起于冰水浴加入5%苯酚水溶液0.5ml，加5ml浓硫酸，混匀，沸水浴5min之后立即取出置于自来水冷却至室温，在最大吸收波长下测定多糖提取液的OD值。将OD值带入标准曲线，算得总糖浓度。

（4）DNS法的标准曲线以及还原糖的测定

葡萄糖标准曲线的制备（DNS法）：按表2分别加入浓度1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水、DNS，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表2葡萄糖标准曲线制作（DNS法）

Tab2productofstandardcurveofglucose(DNS)

按上表分别加入样品，在100℃水浴加热5min显色后立即流水冷却，用9ml纯净水稀释，混匀，在最大吸收波长下，以0号管为空白对照测出1~5号管的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

将灰树花粗多糖提取液取1ml于试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。分别加入2ml3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂进行反应，在100℃水浴加热5min显色后立即流水冷却，用纯净水稀释至12mL，混匀，测OD值。将OD值带入标准曲线，算得还原糖浓度。

多糖得率测定公式：多糖得率(％)=(总糖浓度-还原糖浓度)体积/粉末质量

3.实验过程：

（1）研磨金针菇，用60目筛子过筛获得最终金针菇粉末；

（2）预实验，制定葡萄糖标准曲线（DNS法和苯酚硫酸法）；

（3）确定固定的提取时间、料液比、提取温度以及pH，多次提取多糖，每次提完检测其中多糖含量，确定实验提取次数；

（4）在提取次数固定情况下，设计PB试验对提取金针菇多糖的各个因素进行分析，PB试验中各因素的高低水平取值如表3：

表3各因素的高低水平取值

Tab3Thelevelvalueofeachfactor

N=12时，PlackeR-Burman设计编码水平如表4。

表4PB设计编码水平组合

Tab4thecodinglevelcombinationforPBdesign

每组三次平行提取，获得的粗多糖提取液，测得多糖得率，取其平均值。然后利用Design-expert软件对PB实验结果进行分析，筛选出影响最显著的因素。

（5）最陡爬坡实验

由PB实验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，其中有显著正效应的因素，应增加；有显著负效应的因素，应减小。根据这几个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验。每组获得的粗多糖提取液，测多糖得率，得到一个峰值。然后确定最优条件可能所在的位置，以该条件为响应面实验的中心点。

（6）响应面优化实验

根据最陡爬坡实验的结果，确定响应面法的因素的水平。再根据Design-expert软件，利用Box－Behnken设计原理，最终确定最优条件。

（7）验证实验

用软件得到公式、最优提取条件进行验证试验，平行3次，取平均值。

4. 参考文献

[1]郑义，李超，王乃馨.金针菇多糖的研究进展[j].食品科学，2010，31（17）：425-428.

[2]黄琼，黄晓梅，张平，等.金针菇多糖的抗氧化活性[j].食品研究与开发，2014，35（4）：66-69.

[3]贺伟强，巢新东，陈凌.金针菇多糖生物活性及提取工艺的研究进展[j].食药用菌2014,22(2)：80-83.

5. 计划与进度安排

（1）1-4周：2022-3-2至2022-3-27，查阅文献，制定实验方案，撰写开题报告，学习软件使用；

（2）5-7周：2022-3-30至2022-4-17，开始实验准备工作，进行预实验，熟悉实验方法；

（3）8-14周：2022-4-20至2022-6-5，使用热水浸提法从金针菇子实体中提取胞内多糖，确定最佳的提取方法；