1. 研究目的与意义
背景
茶树菇（agrocybe aegirit）真菌界、真菌门、担子菌亚门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田头菇属。茶树菇是集高蛋白，低脂肪，低糖分，保健食疗于一身的纯天然无公害保健食用菌。经过优化改良的茶树菇，盖嫩柄脆，味纯清香，口感极佳，可烹制成各种美味佳肴，其营养价值超过香菇等其他食用菌，属高档食用菌类。
多糖又称为多聚糖，是由很多个单糖单位构成的糖类物质，是生命活动的四大基本物质之一，是生命机体的重要组成部分与维持生命所必需的结构材料。研究发现:糖类化合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节,如细胞识别、粘连与融合、信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化都离不开糖链的参与。在细胞的生命活动中起到重要的作用。它能激活免疫细胞,提高机体的免疫功能,能够与病毒形成复合物,干扰其与细胞受体的结合,而对正常细胞没有副作用。
2. 研究内容和预期目标
研究内容包括：
（1）将干燥茶树菇磨成粉状。
（2）使用热水浸提法提取茶树菇内多糖，计算多糖得率。
3. 研究的方法与步骤
实验方法及步骤
1.实验前期准备工作：
（1）准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；
（2）将购买的茶树菇晒干磨成粉状备用；
（3）进行预实验，学习并熟练热水浸提法提取茶树菇多糖的方法。
（4）进行次数的单因素试验，确定最佳的提取实验次数。
（5）设计实验表格
（6）Plackett-Burman实验设计法确定重要的几个因素。
（7）由PlackeR-Burman实验结果设计主要因素的最陡爬坡实验，确定响应曲面的中心点。
（8）利用Box－Behnken设计确定最佳的提取条件。
（9）进行验证实验。
2.溶液的配制及标准曲线的制定
苯酚硫酸法测定总糖：
1）0.1mg/ml葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。
2）葡萄糖标准曲线的制备（苯酚硫酸法）：按表分别加入浓度0.1mg/mL的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，
管号 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
蒸馏水（mL） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
葡萄糖标准液(mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
冰水浴加入5%苯酚水溶液0.5ml，混匀，沸水浴5min，冷水浴冷却按上表完成步骤后，测吸光值，最大吸收波长为490nm。测出1～5号管的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
3）将茶树菇初多糖提取液稀释125倍，取1ml余试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。然后一起与冰水浴加入5%苯酚水溶液0.5ml，加5ml浓硫酸混匀，沸水浴5min之后立即取出后置于自来水冷却至室温，在490nm在测定多糖提取液的OD值。将OD值带入标准曲线，算得总糖含量。
DNS法测定还原糖：
1）DNS溶液的配制：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。
2）1mg/mL葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。
3）葡萄糖标准曲线的制备（DNS）：按表分别加入浓度1mg/ml的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂进行反应。 葡萄糖标准曲线制作（DNS法）
管 号 | 1mg/ml葡萄糖标准溶液（ml) | 蒸馏水（ml） | DNS（ml） | 葡萄糖含量（mg/ml） |
0 | 0 | 1 | 2 | 0 |
1 | 0.2 | 0.8 | 2 | 0.2 |
2 | 0.4 | 0.6 | 2 | 0.4 |
3 | 0.6 | 0.4 | 2 | 0.6 |
4 | 0.8 | 0.2 | 2 | 0.8 |
5 | 1.0 | 0 | 2 | 1.0 |
4）将茶树菇初多糖提取液稀释25倍，取1ml余试管；另取1ml蒸馏水代替多糖提取液作为空白对照。然后一起加入2ml3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂进行反应 ，然后在100℃水浴加热5min显色后立即流水冷却，用纯净水稀释至12mL，颠倒混匀，540nm下测OD值。将OD值带入标准曲线，算得还原糖含量。 3.实验基本流程 茶树菇磨成粉状→预实验以及制定标准曲线→次数的单因素试验→PB试验得最显著因素→最陡爬坡实验逼近优化区域→响应曲面实验得中心点→验真实验。
3.实验详细过程
（1）研磨茶树菇粉末，用60目筛子过筛获得最终茶树菇粉末。
（2）预实验，制定葡萄糖标准曲线（DNS法和苯酚硫酸法）。
（3）进行单因素试验，单因素改变其它条件一致，重复三次，得到最佳提取条件。温度90℃，时间4h,料液比1:40，PH8。
（4）根据PB试验表格进行多糖浸提(热水浸提法)表格如下：
浸提温度/℃ | 浸提时间/h | 料液比 | 提取PH | |
1.00 | 90 | 4 | 1:40 | 8 |
-1.00 | 50 | 2 | 1:20 | 5 |
N=12时 PlackeR-Burman设计编码水平如表。
表PB设计编码水平组合
Tab the coding level combination for PB design
run | A：温度／℃ | B：时间／ｈ | Ｃ：料液比 | Ｄ：pH |
1 | -1（50℃） | 1（4h） | -1（1：20） | 1（8） |
2 | 1（90℃） | -1（2h） | 1（1：40） | 1 |
3 | 1 | 1 | -1 | -1（5） |
4 | 1 | 1 | -1 | 1 |
5 | 1 | -1 | 1 | 1 |
6 | -1 | 1 | 1 | 1 |
7 | 1 | 1 | 1 | -1 |
8 | -1 | -1 | -1 | 1 |
9 | -1 | 1 | 1 | -1 |
10 | 1 | -1 | -1 | -1 |
11 | -1 | -1 | 1 | -1 |
12 | -1 | -1 | -1 | -1 |
每组三次平行提取，获得的粗多糖提取液，测得多糖得率，取其平均值。然后利用Design-expert软件对PB实验结果进行分析，筛选出影响最显著的因素
（5）获得的粗多糖提取液，测多糖得率。多糖得率测定公式：多糖得率(％)=(总糖含量-还原糖含量)/粉末质量
（6）利用Design-expert软件对Plackett-Burman实验结果进行分析，筛选出影响最显著的因素。
（7）进行爬陡坡实验逼近优化区域：由Plackett-Burman实验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，其中有显著正效应的因素，应增加；有显著负效应的因素，应减小。根据这几个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验。可以得到最优条件可能所在的位置，以该条件为响应面实验的中心点。（8）利用Box－Behnken设计确定最佳的提取条件
（9）得出中心点后，进行验证实验。
5、数据处理分析，选取最优条件并进行验证实验。分析实验结果，得出结论。
4. 参考文献
1．杨宇博，夏红梅，袁恒翼.植物多糖及其提取方法[j].中国甜菜糖业，2008,2:34～37
2．韦巍，李雪华.多糖的研究进展[j].国外医学药学分册，2005，23179～184
3．李世艳．两株真菌多糖发酵、提取及生物活性研究[d].扬州:扬州大学，2009.
5. 计划与进度安排
1.1-4周：2022年3月2号--2022年3月25号，查阅文献，制定实验方案，撰写开题报告；
2.5-7周：2022年3月29号--2022年4月12号，开始实验准备工作，进行相关预实验，熟悉具体实验方法；
3.8-14周：2022年4月13号--2022年5月24号，对茶树菇进行热水浸提实验，包括次数的单因素实验，pb实验，最陡爬坡实验以及响应曲面实验。最后对中心点的实验验证。
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
