芽孢杆菌漆酶基因定向进化及生物信息学分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1课题意义漆酶(laccase, ec 1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶(blue multi-copper oxidase, mco)家族，广泛存在于真菌、细菌和植物中。据报道，漆酶可作用于250余种底物，漆酶具有广阔的应用潜力，近些年来备受关注。然而，自然界漆酶的产量和酶活力较低，难以适应工业化生产需求。目前，工业化的漆酶主要来源是真菌，而真菌漆酶由于对极端条件易失活的性质，其应用范围有一定的限制。相较而言，细菌漆酶具有耐高温和耐高碱性等极端环境的优点，应用前景较广阔。而应用基因工程技术改进现有菌株或开发新菌株是目前研究领域的热点。越来越多的研究表明,相比于传统方法,采用基因工程技术是开发、生产漆酶的有效方法；与其他的方法相比，基因工程法存在着可以大规模生产、成本低等潜在优势。并且近些年分子生物学和dna重组技术的发展也为漆酶的基因工程化提供了良好的技术支持。在细菌来源的漆酶中，如芽孢杆菌因其无致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、培养条件简单、耐高温等优点成为异源表达和分泌外源蛋白的理想宿主，在基因工程技术和分子生物学研究中日益受到研究者的青睐。

目前关于芽孢杆菌漆酶的报道较少，因此，本课题会尝试将芽孢杆菌属来源的漆酶在基因工程菌中表达，利用定向进化技术获得表达量高、稳定性高的漆酶突变株，通过生物信息学分析进一步研究、实现漆酶的高效表达且达到工业化生产需求。

1.2研究进展漆酶最早被发现于日本紫胶漆树的汁液中，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物，它在工业、农业和食品工业等方面都有着极其广泛的应用。然而，野生菌株的漆酶活力比较低、不易操作、成本高等因素的限制而难以适应商业化生产。如何生产廉价、高效率且高活力的漆酶越来越受到国内外众多学者的关注。对漆酶基因进行改造，实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径之一。分子定向进化是近来热门的一种蛋白质改造的新策略，主要由酶突变文库的构建和高通量筛选构成。突变文库的构建方法主要有随机突变、半理性设计和dna改组三类。随机突变是采用技术手段来诱导目的基因发生碱基的缺失、增添、替换等突变从而构建酶的突变文库，目前最常用的随机突变技术是易错pcr。易错pcr是通过利用低保真度的taq dna聚合酶以及改变pcr反应条件，如加入mn2 、mg2 、dntps和改变循环次数等，降低dna复制的保真度，在新dna链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导dna序列变异的方法[1]。通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，则发展出连续易错pcr。即将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。易错pcr常被用来提高酶活力和稳定性，刘韩等[2]利用易错pcr技术向羧酸酯酶基因中随机引入突变，建立酶基因突变文库，筛选出的突变菌株65产生的酶在90℃的半衰期提高1.2 h。相较于随机突变工作量大的缺点，半理性设计是先通过分析蛋白质结构信息从而确定影响其性质的关键位点或者区域，再利用随机突变或定点饱和突变的手段改造这一关键位点或区域，从而获得有益突变株[3]。reetz等设计的迭代饱和突变，根据待提高的酶学活性，选择其关键的突变位点或区域，进行反复饱和突变，最终筛选出目的突变株[4]。钮成拓[5]根据分子动力学模拟和定点突变的结果，采用迭代饱和突变对芽孢杆菌属来源β-葡聚糖酶进行改造，从中筛选得到突变体，其在70℃处理1 h后仍能保持59.4的剩余酶活，是野生酶经过相同处理剩余酶活的9.43倍。dna 改组是dna分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。这种方法减少了筛选压力，加速积累有益突变。dna 改组的对象既可以是单基因或dna 片段，也可以是基因组或者染色体。易错pcr多用于高频率的诱变单个基因，与dna改组技术联合应用可以集二者的优点，不仅可以对单一基因进行易错pcr随机诱变，创造新的基因，还可以将易错pcr获得的有益基因进行改组，进行序列间的重新编排，从而获得不同种、属基因家族里基因序列变异为更广、功能更强的基因。一般做法是先用易错pcr引入点突变，构建起始基因文库，筛选出所有良性克隆，再以此作为亲本基因进行dna改组，使得有益突变迅速积累，基因功能明显提高[6]。张凯[7]通过一轮易错pcr和两种dna 改组方法联用，经过两轮高通量筛选，最终得到酶活提高两倍的突变株。luo等[8]利用易错pcr和dna 改组联用的方法对磷酸三酯酶进行定向进化，获得的最优突变酶活性提高了25倍。在完成酶突变文库的构建之后，为提高筛选效率，通常使用灵敏度高、操作简便以及筛选底物廉价的高通量筛选。目前使用的较多的高通量筛选方法是平板筛选法和96孔板筛选法，平板筛选法是依据表型进行筛选，如根据产生的溶解圈、抑菌圈的大小来衡量酶活力，比较直观。而96孔板筛选法常用来筛选液态酶，具有测量体积小、测量通量大的特点，同时大大增加了筛选样品的速度，节约了时间。

1.3应用前景漆酶是一种具有广泛工业化用途的酶，由于其能催化多种酚类、芳胺类化合物、化学染料的氧化，同时将分子氧还原成水，能有效降解环境中稳定存在的木质素，催化酚类物质、芳香族化合物等复杂有机物氧化[9-10]，因此，漆酶参与反应所生成的产物是清洁无害、对环境友好的。然而，漆酶的应用需要大量廉价且生产周期短的酶制剂。在自然界中，白腐真菌是漆酶的主要生产者，但野生型真菌的漆酶产量较低，培养周期长，因此限制了漆酶的大量生产和广泛应用，难以满足工业化的生产。如何实现漆酶的高效表达越来越受到国内外学者的重视。随着分子生物技术和基因工程的快速发展，在分子水平上研究漆酶逐渐发展起来。目前，芽孢杆菌来源的漆酶的定向进化报道较少，还未能真正实现漆酶的高效表达且达到工业化生产需求，还需要更进一步的研究挖掘。研究芽孢杆菌漆酶定向进化，利用生物信息学分析，系统了解细菌漆酶，为漆酶大规模的生产和广泛应用提供理论依据，使得漆酶向工业化生产又迈进了一步。参考文献：[1] 许勇. 酶的定向进化及其应用进展[j]. 安徽农业科学, 2018, 46(23) 12-14.[2] 刘韩, 吴丽云, 高贺, 等. 易错pcr法提高土芽孢杆菌zh1羧酸酯酶的热稳定性[j]. 微生物学报, 2015, 55(08) 1060-1067.[3] 于浩然. 理性设计改造荧光素酶的热稳定性[d]. 天津大学, 2014.[4] 李珍华, 章志量, 方秀娟, 等. 酶定向进化技术研究进展[j]. 杭州师范大学学报(自然科学版), 2013, 12(06) 550-554.[5] 钮成拓. 芽孢杆菌属来源1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性研究[d]. 江南大学, 2017.[6] 高义平, 赵和, 吕孟雨, 等. 易错pcr研究进展及应用[j]. 核农学报, 2013, 27(05) 607-612.[7] 张凯. 基于易错pcr和dna改组技术定向改造赖氨酸脱羧酶[d]. 南京 南京工业大学, 2014.[8] luo x j, zhao. j, li c x, et al. combinatial evolution of phosphotriesterase toward a robust malathion degrader by hierarchical iteration mutagenesis[j]. biotechnol bioeng, 2016, 113(11) 2350-2357.[9] 马现成, 张芳芳, 林茹, 等. 漆酶用于环境修复的研究及应用前景[j]. 农业与技术, 2015, 35(3) 8-10.[10] li l, john c. steffens. overexpression of polyphenol oxidase in transgenic tomato plants results in enhanced bacterial disease resistance[j]. planta, 2002, 215(2) 239-247.

[11] 龚睿, 孙凯, 谢道月. 真菌漆酶在绿色化学中的研究进展[j]. 生物技术通报, 2018, 34(4) 24-34.

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标利用定向进化技术对芽孢杆菌来源的漆酶基因进行分子改造，构建漆酶突变库，期望获得活性提高或性能优良的菌株，促进漆酶在工业应用的发展；同时利用生物信息学分析漆酶蛋白的结构，以期找出导致突变的原因，为解析细菌漆酶空间结构与功能的关系奠定基础。2.2研究内容2.2.1芽孢杆菌属漆酶的定向进化以易错PCR来随机突变提取到的芽孢杆菌属的漆酶基因，将易错PCR的产物作为模板进行DNA 改组。经DNA 改组后获得突变基因库，通过高通量筛选法筛选获得高酶活突变株。2.2.2突变酶的生物信息学分析测定漆酶的酶活，并对其进行SDS-PAGE分析，探究其酶学性质的改变。利用生物信息学方法对突变酶进行序列比对、三维结构分析、圆二色谱分析及热变性分析，为探究新型漆酶以及研究其功能奠定基础。2.3拟解决的关键问题漆酶属于含铜的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物。然而，野生菌株的漆酶活力比较低。自然界中绝大多数能够生产漆酶的真菌都受到产量低、不易操作、成本高等因素的限制而难以适应商业化生产。而对漆酶基因进行改造，实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效方法之一，同时也是国内外学者研究的热点。目前，芽孢杆菌来源的漆酶的定向进化报道较少，还未能真正实现漆酶的高效表达且达到工业化生产需求，还需要更进一步的研究挖掘。漆酶基因的克隆及序列分析的主要目的是实现漆酶的高效表达。利用基因工程技术获得漆酶的高产菌株是实现漆酶高效表达的有效途径。通过生物信息学分析导致酶活提高的原因，从而为漆酶的工业化生产奠定理论基础。本课题研究中关键的问题是突变酶文库的构建以及筛选，探究突变酶的结构与功能的关系。推动大规模生产漆酶的进程。

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法及技术路线3.1.1研究方法研究方法包括芽孢杆菌属漆酶质粒的提取，易错pcr反应体系的条件优化、扩增漆酶基因，dna 改组随机突变漆酶基因，含酶突变基因的基因文库的构建以及筛选，突变酶的纯化及生物信息学方法分析。

3.1.2技术路线

见附件

3.2实验方法3.2.1芽孢杆菌属漆酶质粒的提取参照上海生工生物工程公司柱式质粒提取试剂盒说明书。3.2.2易错pcr反应体系的条件优化3.2.2.1 mn2 梯度将mn2 的浓度分别设为0.01，0.025，0.05，0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2，0.225，0.25，0.275，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.6，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，2.75 mmol/l，pcr反应体系：f 1ul，r 1ul，taqdna聚合酶 0.5 ul，pcr-mixed 10 ul，质粒 0.5 ul，用ddh2o补足至25 ul。pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察目的条带。3.2.2.2 mg2 梯度设置mgcl2浓度分别为0.625，1.25，1.875，2.5，3.125，3.75，4.375，5.0，5.625，6.25，6.875，7.5 mmol/l，pcr反应体系：f 1 ul，r 1 ul，taqdna聚合酶 0.5 ul，buffer(无mg2 离子) 2.5 ul，dntp 2 ul，质粒 0.5 ul，用ddh2o补足至25 ul。pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察目的条带。3.2.2.3 dntps梯度设置dntp浓度分别为0.125，0.25，0.375，0.5，0.625，0.75，0.875，1.0，1.125，1.25，1.375，1.5，1.625，1.75 mmol/l，pcr反应体系：f 1 ul，r 1 ul，taqdna聚合酶 0.5 ul，buffer(含mg2 离子) 2.5 ul，质粒 0.5 ul，用ddh2o补足至25 ul。pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察目的条带。3.2.2.4 taqdna聚合酶设置taqdna聚合酶（2.5 u/ul）体积分别为0.2，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ul，pcr反应体系：f 1 ul，r 1 ul，pcr-mixed 10 ul，质粒 0.5 ul，用ddh2o补足至25 ul。pcr反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察目的条带。3.2.2.5 易错pcr条件的正交试验在前期pcr单因素优化条件的基础上，采用正交设计l9(34)对影响pcr反应的mn2 浓度、mg2 浓度、dntps浓度、taqdna聚合酶浓度4个因素，各设置3个水平试验，共9个处理，每个处理设置平行反应，以建立最优pcr反应体系。3.2.3易错pcr扩增漆酶基因在pcr条件优化的基础上，确定mn2 浓度、mg2 浓度、dntps浓度和taqdna聚合酶浓度。上游引物5’-cgcgagctcggagtgtctggtgcc-3’下游引物5’-ccgctcgagctaaatgttgatactcatcat-3’上游引物下划线序列为saci酶切位点，下游引物下划线序列为xhoi酶切位点，引物由上海生物工程公司合成。以漆酶质粒为模板进行pcr扩增，在pcr管中加入10×pcr buffer （无mg2 ）5 μl，上游引物和下游引物（10 μmol/l）各2 μl，模板dna 1 μl，然后按易错pcr确定的最佳pcr条件加入相应的mg2 、mn2 、dntp以及taqdna聚合酶，将它们混合后离心，置于pcr仪上，pcr反应程序：预变性94°c，5 min；变性温度94°c，30 sec；退火温度55°c，30 sec；延伸温度72°c，1 min；30个循环后，72°c延伸10 min。3.2.4 dna 改组随机突变漆酶基因3.2.4.1 亲本基因的扩增以来自易错pcr突变株作为模板，进行以下pcr反应：10×pcr buffer 5.0 μl上游引 物 (10 μm) 2.0 μl下游引物 (10 μm) 2.0 μldntp (2.5 mm) 4.0 μl

模板dna 1.0 μl

4. 研究创新点

4特色或创新之处漆酶是一种具有广泛工业化用途的酶，漆酶的应用需要大量廉价且生产周期短的酶制剂。

在自然界中，白腐真菌是漆酶的主要生产者，但野生型真菌的漆酶产量较低，培养周期长，因此限制了漆酶的大量生产和广泛应用，难以满足工业化的生产。

目前，芽孢杆菌来源的漆酶的定向进化报道较少，还未能真正实现漆酶的高效表达且达到工业化生产需求，还需要更进一步的研究挖掘。

5. 研究计划与进展

5研究计划及预期进展本课题研究计划主要依据“研究目的---研究现状---实验方案设计---实验方案实施---研究结果---结果分析及数据处理---查阅相关资料文献---提出有关问题---解决提出的问题---得出结论”这一线索按顺序展开进行。

本课题预期耗费约9个月，预期进展如下：2019年9月-2019年10月：根据国内、外同类研究的现有基础和最新发展动向，完成文献综述。

2019年11月-2020年2月：学习相关实验知识和技术，补充完善本项目的研究设计方案，并完成立项。