生物信息学方法分析设计pETase辅助结构域开题报告

课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）

1、课题的意义

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），是一种最常见的塑料材料。它是由对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）缩聚而成的高分子化合物，通常以无定型和半结晶的方式存在。目前，全球PET产品的生产和消费不断扩大，PET及其降解的塑料微粒已经对土壤环境和海洋环境带来了巨大的伤害。通常情况下，PET的解决方法包括物理法、化学法和生物法，物理和化学方法常常无法完全降解PET，且容易产生污染物，因此，生物降解具有很大的应用前景^[1]。

目前，已知的PET降解酶PETase能够将PET分解为苯二甲酸乙二醇酯（MHET）、苯二甲酸（TPA）、乙二醇（EG）等原料组成成分，通过这种酶的降解，解决了PET塑料的污染问题，并且还可以进一步回收原料成分，符合健康绿色可持续发展的理念。

2、国内外研究进展

在过去的研究中，研究人员以PET或其模拟物作为底物，在堆肥中进行菌株筛选，分离出具有降解活性的微生物，这些菌株的降解效率很低，研究人员进一步从菌株中分离出一些PET降解酶。这些传统的PET降解酶对无定型态或结晶度低的PET材料具有较高的降解能力，但却无法降解高结晶度PET材料，初步推断可能由于这类降解酶不具有底物专一性，没有合适的酶活性中心容纳高结晶度的PET长链分子。

2016年，日本团队发现了能够降解PET塑料的超级细菌Ideonella sakaiensis 201-F6，并将其中作用的酶命名为PETase ^[2]。与传统的PET降解酶相比，PETase具有如下几种特征：（1）PETase对PET有较高的特异性，不降解其他的聚酯类塑料材料；（2）PETase对低结晶度的PET膜的降解效率是传统的PET降解酶效率的100倍左右；（3）PETase对高结晶度的PET塑料瓶的降解效率是传统的PET降解酶效率的20倍左右；（4）PETase能够在室温（25℃左右）及pH值7.0的条件下发挥降解作用，而传统酶只能在高温条件下才能发挥作用。

由于特异性较高的PETase的发现，多个研究团队展开了对该酶的结构研究。PET降解酶首先要吸附到PET表面才能发挥降解功能^[3]。然而，PET聚合物具有很强的疏水性，不利于降解酶和PET聚合物的有效吸附。研究表明PET降解酶自身没有负责底物吸附功能的特异性结合域，降解酶对PET表面的初始吸附可能是由催化中心附近的疏水区域介导的^[4]。

Roth等最初解析了降解酶TfCut2的晶体三维结构^[5]，该酶采用典型α/β水解酶折叠方式，结构中心由9个平行的β折叠组成，多个α螺旋分布在β折叠的两侧，保守的催化三联体（Ser130-Asp176-His208）位于酶表面的凹槽中。TfCut2能在较高的温度下降解PET，是由于PET分子链发生一定的构象改变，进入酶的活性中心，催化三联体发挥水解作用。TfCut2对PET底物没有特异性，高结晶度的PET也无法进入酶的活性中心，难以进行有效的降解反应。

Araujo等人首次利用较小的丙氨酸代替PET降解酶中较大氨基酸的方式，扩大底物的结合口袋，得到的突变体对PET的水解活性提高了４～５倍^[6]。在此基础上，有研究人员对PETase的底物口袋进行定点突变改造，获得的突变体对PET的水解活性提高了2.3倍^[7]。因此得出结果，增加这类降解酶的底物口袋结合空间在一定程度上提高了酶的催化能力。

当反应温度接近于PET的玻璃化转变温度（约70℃）时，PET的无定型区更容易被酶降解，因此增强酶的热稳定性很有必要。Then等对来自嗜热子囊菌的TfCut2突变体改造的基础上，通过增加盐桥或二硫键可以提高该酶的热稳定性，可在70℃有效降解无定型的PET膜^[8]。

此外，亲水性的PET降解酶无法有效地吸附到疏水性的PET材料表面，在PET降解酶靠近疏水性PET表面时，强烈的疏水作用可能引起酶蛋白质的构象变化而导致酶活的降低甚至完全丧失。研究人员发现可以通过将更多的疏水性氨基酸残基暴露在PET降解酶催化中心旁边可以增加酶的吸附能力^[9]，也有研究将PET降解酶进行截短来增加暴露在蛋白表面的疏水氨基酸残基^[10]。但是，这些方法虽然提高了酶的吸附能力，但也容易对酶活造成损失。之后研究人员通过构建疏水蛋白和PET降解酶的融合表达载体，解决了活力损失的问题，可以大大提高酶的降解能力^[11]。

尽管近年来PETase生物降解PET塑料吸引了广泛关注和研究，关于PETase的发酵水平的考察及其优化的研究较少。然而，大量高效产出PETase是其工业应用的重要前提，因此，研究PETase发酵及其优化具有较高的理论和应用价值。

3、应用前景

由于PET这类高聚物中各单体间的化学键很难被破坏，在普通的塑料回收过程中，仅仅可以实现原料的降级再利用。例如，食品级PET塑料瓶回收后加热溶解成PET颗粒，再重新进行热加工，制成PET纤维，再利用纤维制造塑料绳或者等。而来自细菌的PET降解酶却可以破坏这种高聚物中的化学键，将其还原为对环境影响很小的对MHET和EG。生物酶法具有污染少、能耗低、并且降解产生无害的单体等优点，能为工业大规模降解塑料废弃物提供绿色环保的途径。

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1、研究目标

PETase的发酵条件优化，其中包括表达载体、宿主菌、发酵温度、IPTG浓度等方面因素的优化，提高PETase在工业中的利用效能。

2、研究内容

研究内容包括表达载体的构建、宿主菌的改造、发酵温度的控制以及诱导剂的选择与浓度控制，从而提高PETase的在大肠杆菌中的表达水平。

3、拟解决的关键问题

其他来源的蛋白质在大肠杆菌的异源表达可能面临表达量不高，可溶性差，修饰不完全，活性低等问题，且不同蛋白差异较大，可借鉴性低。本研究拟通过优化大肠杆菌异源表达体系，获得适合PETase高效表达的发酵条件。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1、研究方法以及实验方案

A.质粒转化入大肠杆菌

感受态细胞的制备：感受态细胞，就是处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞，主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞，实验将用CaCl₂对大肠杆菌进行处理，在低温预冷条件下，处于低渗氯化钙溶液中的大肠杆菌细胞膨胀，同时Ca2 会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。

质粒的转化：将质粒 DNA 导入细菌的过程称为转化，感受态细菌细胞在 CaCl ₂低渗溶液中膨胀为球状，质粒DNA与CaCl₂形成抗 DNase 羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子。

B、大肠杆菌的培养

重组质粒的重组菌发酵主要考虑细菌生长和质粒的复制，一般认为, 通过高密度培养就会有较高的质粒表达,实验将采用LB培养基培养大肠杆菌。LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl，其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。种子液培养挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种到小的离心管中进行种子液培养，在恒温摇床中于37℃、180 r/min培养12-16 h，按2%的比例, 将种子液接种于处理好的培养基的摇瓶中, 在恒温摇床中于37℃、180 r/min培养，定时取样，用紫外分光度计测定OD值，对大肠杆菌浓度进行监测。

C、IPTG诱导大肠杆菌表达PETase

在原核细胞的蛋白表达系统当中，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达。在没有乳糖时，Lac操纵子处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，从而诱导表达蛋白。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身，实验中往往使用一种强诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，IPTG不被细菌代谢而十分稳定，因

此被实验室广泛使用。在具体操作中，将重组质粒的大肠杆菌于LB液体培养基中培养至OD为0.6左右，加入0.1-1 mmol/L 的 IPTG，在一定温度下诱导表达一定时间，取2 mL菌液，离心收集菌体，加入100μL的PBS重悬，然后加入25μL的5×的上样缓冲液，吹匀，99℃煮样5 min，进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白进行鉴定。

D、PETase表达条件优化

初始宿主菌的浓度对重组蛋白表达影响：过夜活化的菌株扩培至100 ml LB培养基中,37℃、180r/min震荡培养,分别在细菌生长至OD600为0.4、0.5、0.6、0.8、1时加入IPTG诱导，诱导时间为4h,各取2 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析PETase重组蛋白的表达量,确定IPTG加入的最佳初始菌浓度。

IPTG浓度、诱导表达时间的优化：将已知IPTG加入的最佳初始菌浓度后，诱导表达时，在OD600值相同的情况下加入IPTG,终浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1mmol/L,诱导4h,各取1ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析重组蛋白的表达量,确定诱导剂IPTG的最佳终浓度。在确定IPTG最佳终浓度和加入的最佳初始菌浓度后，在诱导表达时,诱导表达时间分别为3、5、7、9、11 h,各取1 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析重组蛋白的表达量,确定诱导表达的最佳时间。

发酵温度的条件优化：将种子培养基的以2%的接种量分别接种到LB培养基中，在37℃条件下进行扩大培养，在OD600达到0.9时添加IPTG终浓度为0.5 mmol/L，然后将培养基分别置于16℃，30℃，37℃下分别发酵4h，8h和16h。发酵结束后，收集菌体并分析重组蛋白的表达量，确定表达的最佳温度。

E、SDS-PAGE分析PETase表达水平

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)是蛋白分析中最经常使用的一种方法，携带有重组基因的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达相应的重组蛋白，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS—PAGE凝胶上要多出一条明显的条带，因此可以确定重组蛋白的正确表达。

可行性分析

（1）理论可行

经过前期的文献查阅及整理，对所研究的课题有了初步的基础知识积累，在本科的学习过程中所学的生物化学、有机化学、微生物学以及生物分离等课程能够为研究提供足够的理论基础。

（2）方法与技术可行性

本课题采用的方法与技术有：酶工程技术、微生物培养技术以及生物分离技术等，通过查阅文献和学习课程理论知识能够基本掌握研究所需的技术方法，在老师的指导下能够进行熟练的应用，因此有充分的可行性。

（3）研究力量与设备的可行性

食品科技学院酶工程实验室有充足完善的设备供应与专业知识丰富的学姐学长以及优秀的师资力量，能够保证研究的可行性。

特色或创新之处

本项目通过优化PETase异源表达条件，获得高效表达PETase的发酵体系，改善该酶的发酵能力，从而为PETase在工业上的应用提供理论和实践依据。

研究计划及预期进展

2020年1月9日前，阅读相关文献及相关书籍资料，完成文献综述；

2020年1月至2020年4月，完成毕业论文相关实验研究；

2020年5月，完成毕业论文，在老师指导下修改，并准备毕业答辩。