臭卤中主要安全性指标评价及其特色风味组分分析开题报告

全文总字数：5597字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

（一）课题意义

臭豆腐是中国具有悠久历史的传统食品，根据生产工艺的不同分为深度发酵型臭豆腐和本文所研究的轻度发酵型臭豆腐^[1]。目前，轻度发酵型臭豆腐的研究重点在卤水，其生产厂房条件简陋，没有过程控制，卤水发酵程度也没有控制标准，豆腐在卤水中浸泡程度及时间等也完全依赖经验，没有理论依据。使得臭豆腐的品质很难得到控制。本文通过对不同发酵阶段的卤水进行微生物菌落测定、理化指标分析、风味物质检测，对卤水发酵的整个过程分阶段进行监控，试图建立一套针对臭豆腐发酵各阶段终点的评判标准，使臭豆腐的生产更趋于标准化，推动臭豆腐产业化发展，提臭豆腐的影响力^[2]。

（二）国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

（一）研究目标

本课题以臭卤为研究对象，从生物胺、亚硝酸盐、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌等方面，对臭卤的安全性进行评估，并对其特色风味组分进行分析，掌握其卫生质量状况，为卫生监督工作提供科学依据。

（二）研究内容

3. 研究的方法与方案

（一）研究方法

1.臭卤中的测定：采用稀释倒平板法；

2.臭卤中优势菌种的分离与纯化：采取传统的涂布与划线分离，结合简单的生理生化鉴定以及在显微镜下观察菌落形态；

3.臭卤中亚硝酸盐测定:采用分光光度法；

4.臭卤中生物胺测定:采用液相色谱法：：

5.臭卤中特色风味组分分析:采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪进行挥发性分为成分分析。

（二）技术路线

样品

梯度稀释 预处理

PCA培养 MRS培养 孟加拉红 结晶紫 亚硝酸盐 生物胺 气相色谱

基培养 基培养 琼脂培养 中性红胆 标准曲线 标准曲 组分分析

基培养 盐培养基 绘制 线绘制

培养

分光光度 液相色谱 特色风味

计数 计538nm检测样品 物质指纹

波长测吸 溶液 图谱

光度

平板划线法亚硝酸盐生物胺含

筛选优势菌种 含量计算 量计算

微生物群像分析 安全性评估

（三）实验方案

1.菌浓变化测定：

将四个不同阶段的臭卤样品分别稀释五个梯度，采用稀释倒平板法分别用PCA培养基、MRS培养基、孟加拉红琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐培养基培养，并进行菌落计数，计算得到原始样品中总菌、乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌的浓度。

2. 采用稀释平板涂布法和稀释平板划线法进行分离纯化：

将臭卤样品分别稀释到10^-3、10-⁴、10^-5、10^-6，在平板上涂布，倒置于37℃生化培养箱培养36h。培养好的平板挑出来做划线分离,再培养然后观察。将己经分离纯化的菌种经传代次,活化后在平板上画线,观察单个菌落形态,即色泽、大小、边缘整齐与否等等。

3.分光光度法测定亚硝酸盐含量：

吸取40.0mL预处理好的滤液于50mL带塞比色管中,另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液,分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀静置，各加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混匀静置,于波长538nm处测吸光度,绘制标准曲线比较。

4.采用液相色谱法测定生物胺：

（1）提取：准确称取样品10g,置于100mL具塞锥形瓶中,加入500μL内标使用液和20mL5%三氯乙酸溶液,转移至50mL具塞离心管中,5000r/min离心10min,转移上清液。

（2）净化：移取上述试样提取液10mL于25mL具塞试管中,加入0.5g氯化钠和10mL正己烷,静置分层后弃去上层有机相。

（3）萃取:移取5mL上述除脂肪后的试样溶液于10mL具塞离心管中,调节pH至12.0左右。加入5mL的正丁醇/三氯甲烷混合溶液, 5000r/min离心5min,静置分层后转移上层水相于另一个10mL具塞离心管中,稀释至刻度。取5mL萃取液加入200μL盐酸。混匀后40℃水浴下氮气吹干,加入1mL盐酸，使残留物完全溶解。

（4）衍生:在上述溶液中依次加入1mL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液、1mL衍生试剂,置于60℃恒温水浴15min,取出,分加入100μL谷氨酸钠溶液，60℃恒温反应15min。加入1mL水,40℃水浴下氮吹除去丙酮,加入0.5g氯化钠和5mL乙醚,静置分层吸出上层有机相。40℃水浴下氮气吹干。加入1mL乙腈使残留物完全溶解,0.22μm滤膜针头滤器过滤于进样小瓶。将试样的衍生溶液注入高效液相色谱仪中,测得峰面积。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。

5. 采用气相色谱法进行挥发性分为成分分析：

将PDMS的萃取头在300℃的条件下活化60min。称取样品1.00g放入20mL SPME样品瓶中,加入4.00mL超纯水，密封后在70℃的条件下利用磁力搅拌器加热平衡20min。将萃取头通过隔垫顶空插入样品瓶内，使之距样品液面约1cm，顶空吸附40min,再将萃取头插入气相色谱进样口，在240℃条件下解吸5min。用GC-MS检测和NIST2014s标准质谱库检索分析，对臭卤中特殊风味成分进行鉴定。

（四）可行性分析

目前对臭卤中的乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌以及亚硝酸盐、生物胺的测定已经有了广泛而深入的研究。且发酵工程实验室在液相色谱测定生物胺和气相色谱组分分析方面有较强的理论和实验操作技术基础。其余的如微生物培养和微生物分离纯化，都是比较基础的实验方法，应用广泛、操作简单。这些均为本项目的顺利开展奠定了良好的工作基础。

4. 研究创新点

本课题对臭卤不同发酵阶段的微生物菌落测定、理化指标分析、风味物质进行检测，对优势菌种进行分离鉴定，并对各种理化指标进行分析，以对臭卤的安全性进行全面的评估。通过气相色谱的方法对臭卤的风味物质进行分析，以更好的了解臭豆腐风味来源，提高臭豆腐的生产工艺水平，为其监督工作提供科学依据。

5. 研究计划与进展

（一）研究计划

课题拟从2018年11月开始到2019年4月完成。

1.对臭卤中的总菌、乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌进行稀释平板计数，并反复进行分离纯化，对分离出的菌株进行观察和鉴定（一个月）；