植物4-香豆酸CoA连接酶4CL的异源表达与体外催化性质研究开题报告

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1. 研究目的与意义

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是木质素生物合成的关键酶之一，它位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上。4CL以肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物如香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、羟基阿魏酸、芥子酸等为底物，生成各种相应的辅酶A硫酯，这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径。4CL处在总途径向分支途径的转折点，并控制进入不同的苯丙烷类化合物代谢支路，产生不同的次级代谢产物，是总途径进入分支途径的关键酶。目前已从许多植物中克隆了基因及其家族基因，如拟南芥、烟草、紫草、大豆、杨树、欧等，并对反应机制及涉及催化反应的主要氨基酸保守区域等方面进行了研究。对于不同来源的香豆酸辅酶A连接酶的酶学性质和催化功能的探究尚少。然而各植物中酶学特征和催化功能间的差异正是引起黄酮类物质种类和含量不尽相同的主要原因。因此，本研究将来源于不同植物的4香豆酸辅酶A连接酶在大肠杆菌中进行异源表达，并测定酶学性质以及在体外进行催化功能，为植物体内次级代谢产物积累机制的研究及体外黄酮类化合物合成的技术路线奠定坚实基础。

2. 国内外研究现状分析

与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样，4cl基因也属于调控基因，其表达主要受发育的调控。在大多数植物中，4cl以基因家族形式出现。4cl基因家族成员在植物组织中进行差异表达并参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成。例如，4cl在木质素合成中充当重要限速酶，并作为有关调控维管植物木质素含量及组成的关键基因在基因工程技术中起重要作用。4cl的表达可为植物生长所影响，还可受许多环境因子的作用激活，如各种机械伤害，病原微生物入侵以及紫外辐射等，pal、c4h和4cl三种酶对不同环境因子所作出的差异反应说明了它们在苯丙烷类衍生物合成代谢中的作用有所不同。此外，有研究表面，苯丙烷类次级代谢途径产物对人体也具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多重作用。黄酮类化合物具有十分高效的抗癌作用，其发生作用主要通过三种途径，分别为抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长以及对抗致癌因子。致癌因子可导致自由基在体内富集，从而引起脂质过氧化，破坏细胞，进而引发癌症。如今，黄酮类化合物的抗病抗菌作用在医学界已经得到肯定，其抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号转导和促进抑癌基因表达等多种渠道来实现的。芦丁和桑色素能抑制苯并花对小鼠皮肤的致癌作用。槲皮素能在每升毫摩尔的浓度下直接抑制癌细胞的增殖。甘草查尔酮能通过诱导细胞调亡的方式来阻滞乳腺癌细胞和白血病细胞细胞的生长。松树皮中提取的黄酮类物质能诱导细胞凋亡。黄冬苷能强烈抑制种肝癌细胞株拓扑异构酶活性且能抑制肝癌细胞增殖。查尔酮可抑制蛋白激酶的活性阻断细胞蛋白质的磷酸化过程，从而抑制肿瘤细胞的生长。因此研究这条代谢途径中的关键酶成为这些次级代谢产物积累及及体外大量合成的重要手段，也为进一步了解该酶作用机理打下基础。

mansell等首次从嫩柳枝中提取出了香豆酸连接酶，并对4cl的性质进行了详细的研究。4cl对香豆酸的催化作用有较高专一性，故而被称为香豆酸连接酶。而后，studble及其研究小组通过生物信息学软件对该酶蛋白质序列的比对分析发现，n端序列几乎绝对保守，而被认为是4cl催化反应中保守的结合功能域，属于腺苷酸形成酶超家族。位于c端的多肽序列则在所有的4cl中绝对保守，经研究推测该序列可能为酶的部分或全部活性中心，人们逐渐认识4cl始于其基因的克隆。迄今为止，已从多种植物中分离出了编码4cl的基因，如欧芹、马铃薯、烟草和大豆等。近年来，4cl基因调控木本植物木质素的合成逐渐成为了研究的热点。随着研究的深入，了解到4cl基因以基因家族的形式调控苯丙烷类次生代谢物质的形成。在拟南芥中发现有4个有活性的4cl基因，水稻中也发现了5个功能上存在分化的4cl基因，而后在大豆中也发现了4个有活性的4cl基因[3]。当各物种的4cl基因及其同工酶基因的发现和表达调控集中研究过后，其催化反应和底物偏好选择的分子机理又成为研究热点。目前的研究进展主要是通过研究功能域氨基酸位点的突变体酶蛋白的体外功能和蛋白质晶体结构模型，提出可能的分子机理[5]。

在20世纪70年代，对4cl蛋白的研究就已经开始，最初主要是从植物中进行4cl蛋白酶的分离纯化，然后进一步研究提取出的天然酶的生化特性。直到目前，已经从大豆、欧芹、云杉、杨树、水稻、丝瓜、刺槐等植物中纯化或部分纯化出了4cl蛋白。随着从越来越多的植物中发现4cl基因，人们发现4cl基因在这些植物基因组中一般是以基因家族的形式存在的，这些基因家族中的不同的4cl基因可能在调控着苯丙烷类代谢不同的分支代谢途径[5]。同时人们发现4cl基因是组织特异性表达基因，在同一种物种的4cl基因家族中，不同的4cl基因的表达参与不同的分支途径而使其表现出器官、组织和细胞的特异性[6]。例如美洲山杨含有的2个4cl基因pt4cl1和pt4cl2在结构上和功能上均不相同，两者通过差异表达来调控不同的苯丙烷类衍生物合成从而起到不同的生理功能，pt4cl1参与正在发育的木质部组织中木质素的合成，而pt4cl2参与表皮细胞中酚类化合物如类黄酮的生物合成。毛白杨作为我国特有的乡土树种，是重要的绿化和造纸用材树种。饶国栋等人采用pqe30原核表达载体和所克隆得到的4cl全长cdna相连接的方法构建重组原核表达载体，通过阳离子亲和层析的方法纯化原核表达蛋白来完成对4cl3基因的表达与蛋白纯化，而后进一步进行了酶的活性测定分析，并测出克隆的4cl3的最适温度与ph值。后龙松华等人以亚麻为材料，利用race方法对其4cl全长基因进行克隆，对基因功能进行生物信息学分析：与其他植物4cl基因同源性、氨基酸组成及蛋白质二级和三级结构预测。并利用亚麻4cl基因构建rnai载体，进行亚麻遗传转化研究，获得了转基因苗，经分子检测，基因干扰片段已经转入亚麻中，并显著降低了其4cl基因的表达量，这为培育低木质素的亚麻材料和亚麻纤维品质改良的分子育种奠定了基础。虽然经过比对预测，得到大量有关4cl信息，有很高参考价值，但却仍为推测有待实验验证。而选择4cl基因作为干扰对象，是因为该基因在韧皮部有一定的特异性表达，而在木质部的表达量比较低，因此干扰作用主要针对于韧皮部，这样既可以改善韧皮纤维的品质，又能减小对植物正常生长的影响。有利于增强细胞壁刚度以及对植物生长起到机械支持和抗压的作用。凌瑶等人通过研究，克隆得到了苦荞ft4cl基因编码的蛋白质，该蛋白具有植物4cl的典型特征。根据植物中不同4cl同工酶的遗传距离与代谢功能的差异，可以将植物中的4cl分为两大类：i类同工酶参与调节催化黄酮的生物合成；ii类同工酶参与调节催化木质素的生物合成，该类同工酶与结合在细胞壁上的苯基丙酸衍生物在结构组成上相关联。angela等人研究表明，位于clusteri的拟南芥at4cl1和at4cl2均位于黄酮支路，而位于clusterii的at4cl3则位于木质素支路上，butmer等人研究表明，位于clusterii的黑麦草lp4cl归于木质素支路。故该研究推测克隆得到的ft4cl基因与苦荞黄酮代谢相关，都属于4cl基因家族。

3. 研究的基本内容与计划

本实验是通过研究4cl同工酶对底物的结合特异性，以及对4cl基因家族中表达产生的对底物表现有不同的亲和催化活性的具有结构和功能完全不同的各个组分的研究，来对植物4香豆酸coa连接酶的异源表达和体外催化性质进行研究。

1.确定最佳植物来源的4-香豆酸:辅酶a连接酶；

通过基因序列比对等生物信息学手段，对基因库进行基因挖掘，筛选出合适植物来源的4-香豆酸:辅酶a连接酶用于异源表达。

4. 研究创新点

目前国内外文献报道大多数都从4CL基因家族出发，进行研发，4CL在化工、医药和植物抗病抗旱领域都具有重要的应用价值。本课题以该酶在体外的优化催化条件为研究目标，以肉桂酸为出发底物，建立异源表达机构，得到表达产物，提取浓缩进行催化机制研究，具有重要的应用价值。