1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
文 献 综 述
菊粉(inulin)又称菊糖、土木香粉，为天然聚合物，是由D-吠喃果糖以β-2 , 1糖苷键连接多聚果糖。其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构，聚合度2-60，分子量为3000-5000，其分子大小随植物种类、气候条件及收获季节不同而异[1]。它主要存在于菊芋、菊苣和牛蒡等植物的根部或茎部。
菊粉酶是能够水解β－2，l－D一果聚糖果糖苷键的一类水解酶，学名β－2，l－D一果聚糖酶，又叫β一果聚糖酶，2，l－D一果聚糖水解酶（EC 3．2．l）。主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于植物的菊粉酶，其底物专一性较强，仅作用于菊粉;而由微生物产生的菊粉酶大部分都能水解含有β- 2, 1呋喃果糖的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分仅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷键的方式不同，可分为内切和外切两类。
1.内切菊粉酶概述
1.1内切菊粉酶,
内切菊粉酶只作用于菊粉，其随机断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖[2]。因此可通过以菊粉为原料，在菊粉酶的催化作用下，用来生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等产品。
1.2 内切菊粉酶来源
研究表明，丝状真菌[3-4] 和酵母[5]都能产生内切菊粉酶.1996年，Onodera小组第一次从青霉中克隆到内切菊粉酶基因INUA，之后各研究小组分别又从无花果曲霉[3]、黑曲霉[4]和季也蒙毕赤酵母[5]等多种微生物克隆到了内切菊粉酶基因。基因工程技术和现代分子生物学的飞速发展，将安全高效稳定地推动生产制备内切菊粉酶。
1.3 内切菊粉酶制备低聚果糖
低聚果糖是由2-10个果糖或葡萄糖通过糖苷键结合而成的低聚合度糖类，属于功能性低聚糖。功能性低聚糖因其具有对人或动物体内双歧杆菌高选择性的增殖作用和增强机体免疫力等特殊的生理功能，近些年来在食品和饲料添加剂领域中成为研究的热点。Penicillium purpurogenum内切菊粉酶[6]水解菊粉产物以F3、F4、F5、F6为主，水解率为32%。Penicillium sp. TN-88内切菊粉酶水解菊粉24 h前产物以F2、F3、F4为主，水解率为50%; 72 h水解率达70％，产物以三糖为主[7] 。
2.毕赤酵母表达系统概述
2. 1基因工程发展技术
基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白提供了广阔的前景。到目前为止，已发展了多种蛋白质表达系统，比如大肠埃希氏菌表达系统，酵母表达系统，高等真核细胞表达系统等。很长时间以来，人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了很多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点，如遗传背景和生化特性清楚，容易操作，生长迅速，营养要求简单等。但这一系统本身也存在不少缺陷:
(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等;
(2)表达的蛋白很多形成不溶性包含体，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;
（3)背景蛋白很多，纯化复杂;
（4)表达量一般不是很高。
自1979年开始，为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点，从而发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母，它繁殖速度快，能高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等。1981年Hitzeman等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功[8]，此后用该系统还表达了多种其他原核和真核蛋白，但酿酒酵母系统也具有局限性，比如缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不稳定等。因此，人们发展了新一代的酵母表达系统巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统，即甲醇酵母表达系统。
2. 2 毕赤酵母表达系统
毕赤酵母作为一种甲醇利用型酵母菌，从20世纪80年代年开发以来，经过不断的研究，至今已有多个种属被开发出来，主要包括Candida和P idz is两个种属，共有30余种，其中尤以毕赤酵母发展迅速。
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不仅克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白很多形成不溶性包涵体、背景蛋白较多、表达产量低等多种缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无与伦比的优越之处。至今已有300多种外源蛋白在该表达系统中成功表达[9]，已报导的最高表达量分别为22g/L(胞内)[10]和14.8g/L(分泌) [11]
2.3毕赤酵母与其他系统相比的优点
将毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌表达系统相比，见下表1：
表1.毕赤酵母与其他表达系统的比较
特点 表达系统 | 蛋白翻译后加工 | 高密度发酵 | 诱导物 | 表达方式 | 表达量 |
毕赤酵母 | 有 | 可 | 甲醇 | 细胞外 | 高 |
酿酒酵母 | 有（易过度 糖基化） | 不可 | IPTG | 细胞外(分泌能力差) | 较低 |
大肠杆菌 | 无 | 可 | IPTG | 细胞内 | 高 |
由表1可以看出，大肠杆菌缺少蛋白翻译后的修饰和加工，如剪切糖基化形成二硫键等，并且表达量一般不是很高[19]；酿酒酵母产物量不高，不适合高密度发酵；而毕赤酵母自身分泌的的背景蛋白少，糖基化程度极低，易于高密度发酵[20]
2.4外源蛋白在毕赤酵母中的表达过程
异源蛋白在酵母中表达包含四个步骤:
(1)将编码异源蛋白的DNA 序列克隆进含有酵母启动子和转录终止序列的表达框中。
(2)转化及在宿主中稳定维持此DNA融合产物。
(3)异源蛋白在特定培养条件下合成。
(4 )异源蛋白的纯化及其与天然产物的比较[12]
2.5毕赤酵母的应用与展望
近年来，毕赤酵母表达系统应用范围越来越广泛，从20世纪80年代初到现在，人们已经用毕赤酵母表达体系成功表达了500多种蛋白[13]。同时，
(1)毕赤酵母表达系统成功表达了多种外源蛋白，表达产物除人畜药用制品外，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白质以及可以此用于研究晶体结构的蛋白质[14]等。毕赤酵母表达系统还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系而将全细胞作为生物催化剂[15]
（2)毕赤酵母作为一种有用的模型系统用于现代细胞生物学的基础研究，主要用于过氧化物酶体输入和组装、过氧化物酶体选择性自噬降解的分子机制和真核细胞分泌途径的结构与功能等的研究。
3.酶学性质的概述
3.1酶的最适温度及热稳定性
(1)温度对酶促反应的速度的影响体现在两个方面:一方面温度升高，酶反应速度加快;另一方面，随着温度升高，酶逐渐变性失活。酶反应存在一个最适温度，在低于最适温度时，以前一种作用为主，在高于最适温度时，以后一种效应为主。张国青等[16]在毛壳霉内切菊粉酶的性质研究中，在反应系统中，于35一60℃分别测定酶液酶活力。结果显示，最适作用温度为50 ~ 55 ℃。将酶液在不同温度(20 ~ 60 ℃)下保温30min，然后测定残留酶活力。结果表明此菊粉酶在50℃以下较稳定，超过50 ℃酶活性急剧下降，60℃时酶活性完全丧失。
(2)通常对酶的热稳定性测定常通过在一定温度范围内对酶液进行保温，不断升温，进而测定残留酶活力，得出残存酶活随温度的不断升高而变化的趋势，得出某个温度区间变化趋势相对平稳。从而确定，酶的热稳定性区间。
3.2 酶的最适PH及酸碱稳定性
(1)梁海晶[17]在对 AtzB最适反应pH值的测定中于40 ℃条件下，分别考察酶促反应在pH值为5.0, 6.0,7.0, 8.0, 9.0, 10.0的Na2HPO4-NaH2PO4（0.05mo1.L-1)缓冲溶
液下AtzB的活性，上述各pH处理中，最大酶活力设为100%，比较得出其余pH处理中AtzB的相对酶活力，从而确定AtzB的最适pH值。
(2)通常对酶的酸碱稳定性的测定通过配制不同PH值的底物，加入适量稀释的酶液，于一定温度下在一定时间范围内测酶活。从而确定，酶的酸碱稳定性。
3.3 酶的储存稳定性
酶的储存稳定性一般指随着时间的变化，酶抵抗各种因素的影响，保持其活力的能力。酶特定的空间结构决定其生物活性。酶的储存稳定性研究，对于扩大对酶的使用范围，具有重大的实用价值。
3.4酶的其他酶学性质
酶的其他酶学性质还包括一些金属离子对酶的影响，如在对木聚糖酶酶学性质的研究中[18]，Na , Ca2十、Cu2 在较低浓度时，对木聚糖酶活性有激活作用，而在较高浓度下，开始出现抑制，其中Cu2 的抑制作用最为突出;Mg2 ,Zn2 在1 mM及5mM时均表现为不同程度的激活作用;Fe3 , Mn2 对木聚糖酶有抑制作用，其中Fe3 抑制作用最强。
酶的其他酶学性质还包括酶的底物抑制类型，反应机制，动力学等等。
4．本论文研究的目的和意义
目的：毕赤酵母表达内切菊粉酶的酶学性质探究
意义：本课题对内切菊粉酶的最适PH，最适温度，热稳定性，酸碱稳定性,储存稳定性等酶学性质进行定量测定，对于内切菊粉酶的制备和产业化，提供最佳的实验条件参考，具有深刻的意义。
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
具体采用的手段：
(1)测定初始内切菊粉酶酶活力。
(2)测定内切菊粉酶的最适反应条件。包括最适反应温度，最适反应ph。
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