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1. 研究目的与意义

寻求或构建可以同步共利用纤维二糖和木糖的菌株从理论上看不仅可以减少酶解糖化中β-葡萄糖苷酶用量，还可以有效避开木糖发酵中的CCR效应，被认为是葡萄糖木糖共发酵的新出路。凝结芽孢杆菌是用于葡萄糖和木糖发酵制备乳酸的嗜温乳酸细菌。前期研究发现凝结芽孢杆菌NL01在同步糖化发酵亚硫酸盐蔗渣浆制备乳酸过程中所需纤维素酶用量较低，且不需要额外添加β-葡萄糖苷酶，自身具有良好的纤维二糖代谢能力，因此开展凝结芽孢杆菌纤维二糖利用途径分子机制的研究对于通过构建同步共利用纤维二糖和木糖的菌株解除混糖发酵CCR效应十分重要的意义。

2. 国内外研究现状分析

1.国内外同类研究概况

国外对于凝结芽孢杆菌的研究已有70多年的历史，我国还处于刚刚起步阶段。目前，国内凝结芽孢杆菌制剂主要是通过液体发酵方式获得，发酵过程中的多种生理活性物质成分，如有机酸、水解酶、维生素、天然抗活性物质和促生长因子菌随分离的上清液放掉，同时又增加了对污水治理的负担，浪费了资源。所以近年来科学家开始了凝结芽孢杆菌的固体发酵研究。l-乳酸在美国啤酒行业中用于调节ph。在工业生产中，乳酸可用于制革工业，使皮革柔软，细密，从而生产高级皮革。还可用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽，使触感柔软。在医药业中，由于l-乳酸有很强的杀菌作用，被用作消毒剂。聚l-乳酸系无毒的高分子化合物，具有生物相容性，在体内能被分解成l-乳酸而被人体代谢，不引起变态反应。因此可用于制造缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物植片等医药领域。在农业生产中，低度l-乳酸聚合物能够作为缓释材料，或作为可降解农用薄膜在农业生产中具有广泛应用。

1.1 凝结芽孢杆菌特性

凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属。在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，但在我国关于凝结芽孢杆菌的研究和开发起步不久，而且发展缓慢^[2]。凝结芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性乳酸生产菌，其由于发酵温度较高(≥50℃)，可以有效减少染菌的风险和倒罐几率，同时大大减少发酵过程中冷却水的使用，从而达到节约生产成本的目的^[3]。是经美国fda批准的一种普遍认为安全的杆菌类乳酸菌。该菌株生长旺盛，芽孢产率高，乳酸产率高，并经中国药品生物制品检定所检定和批准使用。凝结芽孢杆菌tbc169菌株的芽孢对温度的耐受性强。凝结芽孢杆菌tbc169可以在室温保存，有效期可达24个月。凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）cicim b1821是一株筛选获得的产l-乳酸的嗜热菌。该菌株在34～55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性，50℃时获得最高的比生长速率及最大的乳酸积累量。cicimb1821能在ph为5.0～7.5的范围内保持高菌体活性。氧气的存在利于cicimb1821的快速生长，但导致副产物的积累，而不通氧条件下该菌株也能良好生长，同时产酸速率可高达5.63g/l/h。控制残糖浓度不高于10％的发酵条件，发酵48h，可积累乳酸107.5g/l，副产物的总和仅为1.05g/l，葡萄糖对乳酸的得率为97.5％，所产l-乳酸光学纯度高于99％。此外，高浓度葡萄糖发酵实验显示，该菌株可于高渗透压下利用20％葡萄糖发酵生产l-乳酸，发酵100h后可积累乳酸134 g/l，副产物总和仅得1.12g/l，葡萄糖产乳酸得率为92.0％^[4]。本实验用野生型凝结芽孢杆菌菌株nl01为出发菌株，通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛，最终得到一株木糖耐受力强、l-乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株nl-cc-17。该突变菌株是目前已报道的木糖耐受力最高的菌株。当以100g/l的木糖为底物，50℃发酵72h后，l-乳酸产量达到82.30g/l，糖酸转化率为92.37%，l-乳酸产量较出发菌株提高21.51%，糖酸转化率提高了16.00%。通过初步优化发酵条件，确定该菌株最佳发酵温度为50℃，实验范围内最佳发酵ph值为5.5^[5]。

3. 研究的基本内容与计划

2.研究内容及计划

2.1内容：

（1）纤维二糖对凝结芽孢杆菌木糖利用的影响

（2）葡萄糖对凝结芽孢杆菌木糖利用的影响

（3）凝结芽孢杆菌木糖操纵子和纤维二糖操纵子的转录调控机制解析

4. 研究创新点

3.特色与创新

木糖的微生物发酵利用一直是木质纤维原料生物炼制领域的研究热点与难点。寻求或构建可以同步共利用纤维二糖和木糖的菌株从理论上看不仅可以减少酶解糖化中β-葡萄糖苷酶用量，还可以有效避开木糖发酵中的CCR效应，被认为是葡萄糖木糖共发酵的新出路。通过凝结芽孢杆菌NL01木糖代谢分子调控机制研究，我们可以更加全面的了解凝结芽孢杆菌的多种特性，研究凝结芽孢杆菌对不同碳源的利用效果以及不同碳源对于凝结芽孢杆菌产L-乳酸的影响分析得到凝结芽孢杆菌发酵制备乳酸的最适碳源，为之后凝结芽孢杆菌发酵制备乳酸产业化提供一些比较有意义的信息。