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1. 研究目的与意义

乳酸是世界上最早被利用的三大有机酸之一，其分子中有一个不对称碳原子，因此具有旋光性，分为左旋性乳酸 (L-乳酸) 和右旋性乳酸 (D-乳酸)。作为一种传统的多用途精细化学品， 乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长 调节剂、生物可降解性材料和药物等，在化工、医药和食品加工等领域有着广泛的用途^[1]。L-乳酸与人体以及其它动物和微生物的高度亲和性，所以其能更好的使用于人类的生产活动中。目前L-乳酸聚合物在生产可降解聚合物的研究方面已成为全球关注的热点，但是，由于乳酸生产成本偏高，使得聚乳酸制造成本居高不下，难以在价格上与传统塑料竞争。因此，如何高效低成本地生产 L-乳酸显得尤为重要^[2]。实验组在前期通过途径改造删去旁路代谢，并整合来自于凝结芽孢杆菌中的L-乳酸脱氢酶基因，获得一株木糖产L-乳酸的大肠杆菌代谢工程菌。发现在其发酵培养基中添加0.1 mol/L甲酸钠，细胞生物量和乳酸产量均大幅提高，推测主要原因是添加甲酸钠会提高细胞内辅因子NADH和ATP的水平，尤其是ATP。来自于大肠杆菌自身的聚磷酸激酶（PPK）可以多聚磷酸为底物，并将磷酸基团转移至ADP生成ATP。因此本论文拟通过在该工程菌KSJ316中过表达聚磷酸激酶基因(ppk)，探究细胞内ATP的浓度对该菌株L-乳酸生产的影响。这对于探究大肠杆菌代谢工程菌高产L-乳酸，真正实现木糖制备L-乳酸的应用具有重要意义^[3]。

2. 国内外研究现状分析

1.国内外同类研究

2.1 生物质原料的利用现状及存在问题

2.1.1 生物质原料的利用现状

目前，我们所利用的能源主要是有限的且不可再生的化石燃料及其转化能。随着石油资源的日渐枯竭和环境恶化带来的生存危机，生物质原料的竞争优势愈加显现，生物质原料的开发利用受到世界各国的高度重视，研究基于植物原料的新工业品和拓展植物原料在工业生产中的应用是实现可持续发展的途径之一。美国 2007 年公布^[4]，将加大木质纤维素材料转变为乙醇和化工原料的研究，解决目前乙醇生成严重依赖玉米的状况；我国也把大力发展可再生能源作为十一五规划的重要目标^[5]。因此，以生物质为原料采用生物转化法生产燃料乙醇以及以聚乳酸（pla）为代表的可降解塑料等取代石化能源和石油化工高分子塑料的技术变革即将到来。

2.1.2生物质原料利用存在的问题

在植物纤维原料高效转化与利用技术中，最关键的问题之一就是如何实现全组分利用。木质纤维原料主要为由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中半纤维素含量可达20~35%，在酸或酶的作用下可降解成可发酵性的戊糖（主要包括木糖），但与葡萄糖相比，这些大量的木糖资源尚未得到同等有效的利用^[6,7]。其原因是微生物对戊糖的分解转化速度慢、转化率低。尽管自然界中的许多微生物都能够利用戊糖，包括细菌、酵母和真菌，但绝大多数微生物对戊糖的利用要明显差于对葡萄糖的利用能力，且存在代谢物阻遏效应，即当戊糖和己糖同时存在时，戊糖的代谢受到抑制^[8,9]。木糖的微生物发酵利用一直是木质纤维原料生物炼制领域的研究热点与难点。提高微生物对木糖的利用能力，对于实现木质纤维原料高效利用，降低生产成本及提高资源利用水平均具有重要的意义^[10,11]。

2.2 微生物发酵产乳酸

2.2.1 乳酸的性质和应用

乳酸，学名2-羟基丙酸，α-羟基丙酸或丙醇酸，分子式为c2h5ocooh，是一种天然存在的有机酸。乳酸，学名2-羟基丙酸，α-羟基丙酸或丙醇酸，分子式为c₂h₅ocooh，是一种天然存在的有机酸。再水溶液中乳酸的羟基释放出一个质子，形成乳酸根离子。乳酸分子中的α位碳原子上分别连接了四个不同的集团，是一种自然界最小的典型手性分子，根据旋光特性不同，可将乳酸分子分为d-型（右旋），l-型（左旋）和dl-型，其中只有l-乳酸能够被人体和微生物吸收利用。

3. 研究的基本内容与计划

3. 研究内容及计划

3.1 研究内容

（1）在基因工程菌株ksj316基础上，在原ldha位置整合ldhl基因，构建ksj503菌株；

（2）不同l-乳酸脱氢酶表达方式对木糖制备乳酸的影响；

（3）比较不同柠檬酸、乙酸、甲酸钠浓度对基因工程菌ksj316和ksj503细胞生长、乳酸生成、nadh/nad 、atp水平的影响；

4. 研究创新点

本论文将来自凝结芽孢杆菌NL01的ldhL基因整合到E. coliKSJ316的ldhA基因的位置，考察不同的L-乳酸脱氢酶表达方式对木糖制备乳酸的影响。同时，在构建的基因工程菌中过表达ppk基因，探究ATP水平对L-乳酸产量的影响。通过添加不同的外源添加物，考察其对L-乳酸产量的影响，找出影响L-乳酸产量的关键因素。