1. 研究目的与意义

当今世界的能源问题突出，生物乙醇被当今认为最有前景的替代能源。提高纤维素酶活力,降低其成本是生物乙醇生产技术的关键。

现有的纤维素酶酶活低，生产成本高，是制约整个工程的瓶颈。围绕提高纤维素酶活力、降低纤维素酶生产成本已展开了不少研究工作：（1）用基因工程的方法来高效表达纤维素酶；（2）用蛋白质工程的方法来改造纤维素酶，进行定向进化等；（3）在高效降解纤维素的生物如白蚁、福寿螺中寻找高性能的纤维素酶，克隆有关基因在微生物中表达来生产纤维素酶等。这些方法的成功可能还需要一些时间，即使获得了成功，还必须通过生化反应来生产所需要的产物。因此，必须就现有生产菌株，研究其生长代谢的一般规律，充分挖掘其生产纤维素酶潜力，最大限度地提高其纤维素酶的生产能力，从而降低纤维素酶的生成成本。

用来生产纤维素酶的菌种很多，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属等。研究的较清楚的是里氏木霉（trichodermareesei），其中里氏木霉rutc-30是目前公认的最好的产纤维素酶菌株。本文通过对微晶纤维素分批补料的研究，为进一步提高里氏木霉生产纤维素酶的生产能力、降低纤维素酶的生产成本提供科学依据。

2. 国内外研究现状分析

纤维素分子是由葡萄糖通过β-l,4-糖苷键连接起来的链状高分子。植物纤维素结构复杂，分子的聚合度变化很大，一般由7,000～15,000个葡萄糖残基组成，基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15～40根纤维素分子长链集合而成的分子束，由结晶区域和无定形区域构成。纤维素结晶区域是由纤维素分子进行非常整齐规则的折叠排列而成。在结晶区域里，葡萄糖分子的羟基与分子内部或分子外部的氢以氢键相结合，没有游离的羟基存在，所以纤维素分子具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入到内部。因此，纤维素的结晶部分比无定形部分难降解。许多学者研究了纤维素分子链的构型。第一个典型的纤维素分子模型称为缨状纤维束模型，该模型假设大分子都是延伸不弯曲的，方向和纤维束平行，在纤维束中会间隔地出现结晶区，结晶区之间被一些无定形区所分隔，结晶区的平均长度为500（自然纤维）或150（再生纤维），在一般的纤维素分子中，结晶区和无定形区要交替10次以上。另一个典型的模型称为折叠链纤维束模型，该模型认为纤维素大分子折叠起来并沿纤维束轴排列，折叠起来的分子形成一个薄片，构成纤维束的基本单位，结晶区和前一个模型相似，在纤维素分子链中有一部分并没有折叠起来，而是单股松散地依附在相邻两个片状结晶体上，片状组织分子链折叠部位的糖苷键与直链上的糖苷键在结合强度上不同，折叠部位的结合强度弱，纤维素分子的无定形区在片状组织的两端，而结晶区在片状组织的中心部位。

纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是多组分酶系，因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称。

纤维素酶是一类诱导酶。研究发现，所有的微生物以纤维素为碳源时所合成的纤维素酶酶活力比用其它碳源高。ryu和reese等发现少数的微生物利用纤维二糖、乳糖和槐糖也能诱导产生完整或不完整的纤维素酶系。一些化合物如棕榈酸酯及纤维二糖乙酸酯和纤维三糖乙酸酯也同样具有诱导纤维素酶的功能。

通常，纤维素酶的诱导物是纤维素酶的作用底物。纤维素酶的其他作用底物还包括纤维素粉cf11、水杨苷、结晶纤维素或微晶纤维素（avicel）、羧甲基纤维素（cmc）及其钠盐（cmc-na）、羟乙基纤维素、对-硝基酚、β-葡萄糖苷、无定型纤维素、纤维四糖、硫酸纤维素、磷酸膨润纤维素、纤维糊精和脱脂棉等。

目前，研究者普遍接受的纤维素酶的诱导机理是：微生物中的少量纤维素酶首先将纤维素水解成可溶性糖，生成的糖转糖苷后形成真正的的诱导物进入细胞内，直接或间接地影响细胞纤维酶蛋白质的合成，促进纤维素酶的基因表达。

目前普遍被接受的理论认为在t.reesei的分生孢子上存在微量组成型纤维素酶引发了纤维素的诱导作用。t.reesei中纤维素诱导产酶的过程下图所示。纤维素在内切和外切酶作用下少量降解成纤维低聚糖；纤维低聚糖在β-葡萄糖苷酶作用下，一部分降解成葡萄糖，一部分通过转糖基形成槐糖；纤维低聚糖、葡萄糖和槐糖进入细胞，纤维低聚糖在原生质膜结合β-葡萄糖苷酶作用下继续形成葡萄糖和槐糖；槐糖引发诱导，合成纤维素酶；纤维素酶分泌到细胞外降解纤维素，继续形成纤维低聚糖，如此循环纤维素酶不断分泌直至纤维素耗尽。

3. 研究的基本内容与计划

本实验选择碳源微晶纤维素进行产纤维素酶实验。

1、设计不同量硫酸铵和尿素作为氮源连续发酵产酶，设计时间间隔测酶活、ph、菌丝体和剩余氮源 。找出最优的c源质量。

2、利用最优c源，固定的n源（硫酸铵尿素不同）进行试验，找出最优的硫酸铵:尿素

4. 研究创新点

采用不同的碳源氮源培养产酶，不同的分批补料方式,优化来自不同氮源中氮源素的比例，优化c源和n源的比例，找出最优比。设计不同的初始c源质量和n源质量。