菊粉酶基因在大肠杆菌中的表达纯化与活力测定开题报告

1. 研究目的与意义

菊粉酶催化植物中的果聚糖水解，根据其作用方式不同分为两类：一是内切菊粉酶，主要水解产物是低聚果糖；另一类是外切菊粉酶，水解产物主要为果糖。

低聚果糖具有增殖人体内双歧杆菌，抑制肠道沙门氏菌和腐败菌的生长，促进肠胃功能，防治便秘，增加维生素的合成，提高人体免疫功能，控制血糖，降低血脂等诸多调节功能和保健作用，已经作为功能性配料应用于食品、医药行业。内切菊粉酶可以水解菊粉一步法生产高纯度低聚果糖，具有巨大的工业应用潜力，其实现的关键是要具备生产没有外切菊粉酶和转化酶活力的高效内切菊粉酶的技术。但内切酶与外切酶性质相似，很难将内切酶从中分离纯化，无法生产高纯度低聚果糖。因此，利用基因工程技术构建内切菊粉酶基因工程菌，期望获得内切菊粉酶的表达，以实现在工业生产中的应用。

2. 国内外研究现状分析

一、国内外研究现状

国内外对菊粉酶的研究主要集中在五个方面，即筛选高酶活、稳定性好的菌株；进行诱变育种以得到高产突变株，以及去阻遏的突变株；酶学性质及产酶发酵条件的研究；分离提取菊粉酶的dna片段，分析dna顺序，进而推导出氨基酸顺序；克隆并高效表达菊粉酶基因，构建基因工程菌。目前报道最多的是采用固定化酶或细胞等技术对利用菊粉酶生产果糖、果葡糖浆、低聚果糖、乙醇等进行细致的工艺和生产应用研究。

国外关于菊粉酶的研究始于20世纪70年代，20世纪80年代以来已报道了很多菊粉酶高活性菌株，在利用微生物菊粉酶生产超高果糖浆和酒精发酵、菊粉酶及其产生菌的固定化技术以及菊粉酶在生产上的应用等方面进行了研究。

3. 研究的基本内容与计划

（1）以大肠杆菌bl21(de3)为表达宿主，对重组质粒petduet-inu进行诱导表达；

（2）确定合适的诱导表达条件；

（3）确定菊粉酶的酶活力测定方法；

4. 研究创新点

本实验是利用基因工程的原理和方法，将来源于黑曲霉的内切菊粉酶基因克隆到表达载体pETDuet上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌经IPTG诱导后对表达产物进行纯化分析和酶活检测以及酶水解产物分析，检测酶液的内切菊粉酶活性以及水解产物。