凝结芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其原核表达开题报告

1. 研究目的与意义

凝结芽孢杆菌是一株近年来受到广泛关注的生物质高效利用工业菌株，该菌可通过同型乳酸发酵途径转化葡萄糖和木糖生产高光学纯度的L-乳酸，其发酵转化率较高，能源消耗较少。前期研究发现该菌株具有较强的纤维二糖利用能力，但机制不明，基因组数据分析其具有编码β-葡萄糖苷酶基因。本实验针对以上问题，以凝结芽孢杆菌作为出发菌株进行β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其原核表达，通过考察凝结芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的活性来佐证其纤维二糖降解机制。

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基；能够参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。在纤维素的糖化作用中β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。因此对于β-葡萄糖苷酶的研究具有重要的理论和实用价值。本课题利用基因工程的原理和方法，试图将来源于凝结芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因克隆到表达载体pETDuet-1上，并确定该基因的碱基序列，构建能高效表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌基因工程菌。

2. 国内外研究现状分析

2.1β-葡萄糖苷酶的定义，来源及分类

β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。

1837年Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。该酶在自然界中的分布广泛，在植物的种子和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也发现该酶的存在。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candidapeltata)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝、猪小肠等[1]。

几乎所有的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差。能裂解C-O糖苷键、C-S键、C-N键、C-F键等；有些对糖基部分的C和C构形也不专一，能同时水解β-葡萄糖苷酶键和β-半乳糖苷键，有些甚至C位的专一性也不高，能水解木糖。但在所有底物中，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强。在β-葡萄糖苷酶C端的高度保守序列可能与结合糖苷底物有关，在这区段的微小差异决定了β-葡萄糖苷酶的不同底物特异性[2]。

2.2β-葡萄糖苷酶的结构与性质

2.2.1β-葡萄糖苷酶的结构及催化机制

按糖苷酶的氨基酸序列分，大多数β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族1，糖苷酶族1有明显的桶装结构。但是，也有一些β-葡萄糖苷酶属于糖苷酶族4，属于糖苷酶族4的β-葡萄糖苷酶往往要求在催化过程中有脱辅酶和辅助因子参与，有文献报道，6-磷酸-β-D-葡萄糖苷酶在催化过程中需要Mn2 和辅酶NAD 的参与。有研究表明，β-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基。采用定点突变的方法证明，靠近N-端的谷氨酸是酸碱基团，另外一个是亲核基团。多数β-葡萄糖苷酶中起催化作用的是两个谷氨基酸残基，其中，靠近N端的谷氨酸起酸/碱作用，另一谷氨基酸起亲核试剂的作用。但Grabnitz等人研究发现来自Clostridiumthermocellum的β-葡萄糖苷酶的活性部分在N端的130个氨基酸区域，该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His-Asn-Glu-Pro，存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔35～55个氨基酸的His和Glu，其中质子化态的完全保持残基Hisl21作为质子供体与Glu166协同稳定氧碳正离子。高度保守的C-端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合，其中在该区的一些微小差异与不同β-葡萄糖苷酶的底物特异性有关。Shoseyov等通过用2-脱氧-2-氟基-β-D-糖基氟化物对该酶活性部位亲核体鉴定发现：bgl1氨基酸序列排布中Asp261完全保守，此完全保守性与催化亲核体的关键作用完全一致。除了可形成共价糖基化酶中间体和稳定氧化卡宾体的类离子过渡态外，亲核体还可调节酸/碱催化碱基的电离状态，并且过渡态中还在糖状物的2-羟基位置上形成很强的氢键[3]。

经研究证明β-葡萄糖苷酶在催化糖苷键的裂解反应时遵循两步双取代反应机制，其中有两个关键的活性部位羧基参与。其反应方程式如下：

第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES（反应速率常数分别为K1和

K－1）。

第二步是酶－底物中间体（E-S）的形成（反应速率常数为K2）：酶的一个羧基（亲核体）攻击底物的端基异构体的中心部位，而另一个羧基（酸、碱催化剂）则使糖苷中的氧质子化，因此可辅助苷元的脱离，从而形成共价的β-糖基酶中间体（E-S）。在此过程中，BGL的活性中心可根据不同类型的底物而相应地发生一定程度的结构变化，从而使BGL可以和多种糖类底物结合，这一步决定了BGL具有底物专一性[4]。

第三步是中间体的水解，由水按碱催化机制对端基异构体进攻，形成β-糖基产物并使酶恢复其初始的质子化态。BGL在整个反应过程中其构型保持不变。

2.2.2性质

一般来说，不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大，最适pH相差不多，最适温度因其来源不同而相差很大，表1列举了一些不同来源的β-葡萄糖苷酶的理化性质。

表1不同来源的β-葡萄糖苷酶的理化性质

β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在40-250kDa之间。已报导的β-葡萄糖苷酶的pI大多数都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5～5.5之间，但最适pH可以超过7.0，而且酸碱耐受性强。β-葡萄糖苷酶的最适温度在40～110℃之间都有分布；一般来说，来自植物的β-葡萄糖苷酶最适温度在40℃左右，而来自古细菌的β-葡萄糖苷酶其热稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的β-葡萄糖苷酶。对于工业应用来说，酶的热稳定性越高越有利。因此，从嗜热细菌中分离β-葡萄糖苷酶引起了人们的兴趣。

2.3β-葡萄糖苷酶的制备方法与用途

不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少[10]。

作为风味剂：β-葡萄糖苷酶在食物中可以与鼠李糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等风味酶协同作用于风味前体物β-糖苷，促进挥发性糖苷配基的释放，起到增香作用。如李平等研究发现黑曲霉β-葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、茶汁的增香效果良好。目前β-葡萄糖苷酶广泛应用于茶叶、果汁和果酒中增香，其应用逐渐得到开发。

作为脱苦剂：陶宁平等研究发现葡萄糖苷酶可以把青梅中的苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分子葡萄糖，而使青梅苦味大大减少。虽然分解出的氢氰酸有时可使人食后中毒，但氢氰酸可在加热过程中蒸发掉，而且据报道，一定剂量的苯甲醛和氢氰酸混合物具有防癌效果。因此经常作为柑橘、橄榄中的去苦剂，除去苦味。

用于生产低聚龙胆糖：目前，工业上对β-葡萄糖苷酶的主要应用是生产低聚龙胆糖。低聚龙胆糖比麦芽糖浆具有更高的吸水性和较低的粘度，可预防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和显著的保健功能。目前我国低聚龙胆糖的产量仍很小。

用于生产大豆异黄酮：大豆异黄酮可调控动物机体养分代谢，改善饲料利用率，可改善动物产品的品质，并有抗氧化作用，可以提高动物免疫功能和生产机能。但是大豆异黄酮主要以结合型的糖苷(glucosides)形式存在，而研究发现：结合型的糖苷不具有最佳的生理活性状态。β-葡萄糖苷酶能使大豆异黄酮苷等生物苷类物质脱去糖基，变成分子量较小的高生物活性苷元，进而提高生物利用率。据报道，豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物，都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷。

制造生物酒精：将β-葡萄糖苷酶与纤维素内切酶、纤维素外切酶基因转入酵母菌中进行同步糖化发酵制造生物酒精。同步糖化发酵过程是将生物质水解产生还原糖和还原糖发酵产生乙醇组合到一起，在同一步骤进行，这样一方面可以使还原出来的糖被酵母利用生成乙醇，解除了产物对酶的抑制作用；另一方面降低了发酵罐中的糖含量，从而降低了染菌几率。2005年，全球生物酒精的需求量已达到38.27millionkL，但目前使用的原料是淀粉和蔗糖，严重影响了产量，利用同步糖化发酵可利用廉价的原料如麦麸、稻壳等进行工业酒精的生产，降低了成本。

防治病虫害：植物中β-葡萄糖苷酶在防御害虫方面起着非常重要的作用，它能分解植物中丰富的葡萄糖苷DIMBOAGlc，释放有毒的苷配基部分DIMBOA，是植物体中防御食植动物和害虫的主要化学物质。而且，该酶可以水解野黑樱苷，释放HCN，对植物体也起到一定的抗病虫害作用。ShuWei，YanivSemel等将黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因转入烟草中进行表达，提高了对粉虱的毒杀能力。

其他：据报道无色的靛蓝苷在β-葡萄糖苷酶水解作用下即可形成天然色素靛蓝，因此β-葡萄糖苷酶可用于生产天然染料。根据β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力还可以将其应用于乳品业来分解乳糖，与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白，以应用于饲料工业和医药领域等。日用化工业中，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，可以生产非离子表面活性剂烷基糖苷[11]。

2.4β-葡萄糖苷酶的克隆与表达

目前，国内外对β-葡萄糖苷酶分子方面的研究主要是：用基因工程技术构建含β-葡萄糖苷酶基因的克隆菌株；表达具有较高酶活力的β-葡萄糖苷酶；通过分子演化和设计来提高酶的功能性。β-葡萄糖苷酶基因重组表达是当前β-葡萄糖苷酶研究热点之一，已有很多不同来源的β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和酵母菌中得到高效表达。

2.4.1β-葡萄糖苷酶基因的克隆

到目前为止，有上百个微生物、植物和动物中的β-葡萄糖苷酶基因已得到克隆并被测序，其中以微生物和植物为主。Pranita等将Pichiaetchellsii的β-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、测序并将其在大肠杆菌中表达，分析得到开放阅读框1515bp，预测编码蛋白质量54kDa，将表达后的酶液进行SDS-PAGE，结果证明蛋白质量为52.1kDa。李远华等将与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树β-葡萄糖苷酶cDNA通过pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到EscherichiacoliBL21zztrxB(DE3)中表达，诱导产生了63kD的融合蛋白，并主要在细胞质中以可溶性蛋白形式存在。融合蛋白具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应[1]。

早期β-葡萄糖苷酶基因的克隆是通过构建总DNA文库或鸟枪法进行活性筛选的方式获得的。随着PCR技术的应用，可根据种属相似性进行扩增克隆得到β-葡萄糖苷酶基因。随着基因组学的发展，越来越多的微生物基因组全序列被测定。通过序列筛查定位分析出可能的β-葡萄糖苷酶基因，是获得β-葡萄糖苷酶新基因的有效手段。

近年来，热稳定性的β-葡萄糖苷酶成为研究热点，刘军等2007年从一株嗜热子囊菌中分离出耐热的β-葡萄糖苷酶，该酶在70℃高温下仍有活性，序列分析表明该酶属于水解酶家族3成员[12]。

2.4.2β-葡萄糖苷酶基因的表达

β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中起关键作用，但其含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。因此，通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。为此，已经有很多种β-葡萄糖苷酶基因被构建到不同的工程菌中。

许多研究表明，β-葡萄糖苷酶基因可以在大肠杆菌中表达。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产，但是，缺少真核生物的翻译后加工过程。赵云等将多粘芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因重组到E.coliBL21中，在培养液中表达的β-葡萄糖苷酶活性达到24.7IU/mL[20]。刘军等用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg，将其克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)表达载体pET28a( )上，电击转化E.coliBL21(DE3)，获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0[12]。赵林果等将黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达，测序结果表明，获得的目的基因片段大小为2583bp，与原序列相比核苷酸序列同源性达98.88%，氨基酸序列同源性达99.77%[13]。

随着真核表达体系的建立与完善，根据近年来研究表明，β-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中表达的表达量和酶活性普遍要高些。最近10年，许多细菌和真菌的β-葡萄糖苷酶基因已经在酵母菌中成功地克隆和表达。酵母表达系统兼有大肠杆菌表达系统的优势：既便于培养，便于基因操作，成本低，繁殖快，又可对真核基因产物进行翻译后加工，得到正确折叠、有活性的蛋白[14]。

2.5β-葡萄糖苷酶的活性测定

β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性[15]。

2.6凝结芽孢杆菌

凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门，属于肠道乳酸菌，又称为有孢子性乳酸菌。是经美国FDA批准的一种普遍认为安全的杆菌类乳酸菌。关于凝结芽孢杆菌的最早记录见于HammerB.W.在1915年发表的论文。1932年俄国科学家L.M.Horowitz-Wlassowa和N.W.Nowotelnow在其发表的科学文献中首次使用了孢子乳杆菌（Lactobacillussporogenes）来描述凝结芽孢杆菌。根据第8版《伯杰氏鉴定细菌学手册》（BergeysManualofDeterminativeBacteriology）的记载，能够形成孢子、又能产生乳酸、兼性耗氧或者需氧的杆状菌。1980年，学术界统一规范命名了凝结芽孢杆菌，其模式菌株为ATCC（美国典型培养物保藏中心）7050。

凝结芽孢杆菌是一株近年来受到广泛关注的生物质高效利用工业菌株，该菌可通过同型乳酸发酵途径转化葡萄糖和木糖生产高光学纯度的L-乳酸，其发酵转化率较高，能源消耗较少。凝结芽孢杆菌还被报道可以直接利用纤维二糖产乳酸，有效的缓解了纤维二糖对纤维素酶的抑制作用，提高了原料利用率和酶解效率的同时也可以大大地减少木质纤维素应用中因纤维素酶带来的高的酶成本木质纤维素利用成本中的一个重要组成部分[16-18]。前期研究发现该菌株具有较强的纤维二糖利用能力，但机制不明，基因组数据分析其具有编码β-葡萄糖苷酶基因[19]。

2.7国内外的发展前景

目前β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在高效产生菌分离、酶作用机理、酶生理生化特性及β-葡萄糖苷酶基因克隆上。

β-葡萄糖苷酶的理化性质研究得比较透彻，但是对它的应用开发研究力度还是不够。在饲料工业上，β-葡萄糖苷酶通过破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率[20]。此外，在食品开发上，其作为特殊的风味酶已得到应用，如李平等将黑曲霉β-葡萄糖苷酶应用在果汁、茶汁、果酒等制备上，能起到较好的增香效果。

今后对β-葡萄糖苷酶的主要研究应放在其应用开发方面，而不是去寻找新的、更广泛的来源，加大其在食品保健品、饲料、医药行业的开发，以实现其酶制剂的价值。

3. 研究的基本内容与计划

3.1研究内容

本课题利用基因工程的原理和方法，试图将来源于凝结芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因克隆到表达载体petduet-1上，并确定该基因的碱基序列，构建能高效表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌基因工程菌。

3.2计划

4. 研究创新点

首次将来源于凝结芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因克隆到表达载体pETDuet-1上，并确定该基因的碱基序列，构建能高效表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌基因工程菌。