随机突变改善海藻糖合酶热稳定性的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-键结合而成的非还原性双糖，是一种安全稳定的天然糖类，海藻糖以优良的特性，已成为疫苗，酶，活体组织和细胞的生物活性保存的重要保护剂，海藻糖对酸和热的高度稳定性，防止淀粉老化和蛋白变性，抑制脂肪酸败，矫味矫臭功能，高玻璃化转变温度，低吸湿性，低甜度等特性，也使得它在食品加工业，医药业，农业，生化制品业和化妆品行业得到广泛应用，成为上万种产品的添加剂[1]。

在本实验室前期的研究中我们构建了能表达PseudomonasstutzeriA1501海藻糖合酶的大肠杆菌，我们发现，其麦芽糖转化率为72%，该酶催化麦芽糖与海藻糖相互转化的过程中几乎没有副产物葡萄糖生成，这为利用海藻糖合酶生产海藻糖提供了一定基础，但是实际使用过程中存在如下问题：（1）我们海藻糖合成酶极不稳定,一般低温存放一个星期它们就会解聚变性失活。（2）目前海藻糖合成酶在工业上应用一般需要催化72h左右,但我们通过前期实验发现该海藻合成酶40℃放置6h后相对酶活只剩30%。大于40℃时热稳定性下降更为剧烈。如果酶蛋白稳定性不好,不能一直保持较高的催化活性,那么它在工业应用上就变得没有意义。

2. 国内外研究现状分析

2.1海藻糖

2.1.1海藻糖结构

海藻糖(trehalose)又称蕈糖或者蘑菇糖，是一种非还原性二糖。许多生物都能合成海藻糖，包括细菌、真菌、植物以及动物。人类不能合成海藻糖[2-3]，但是可以利用该糖。海藻糖是由两分子的葡糖糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，无水海藻糖分子式为c12h22011，分子量为342。根据旋光性质的不同，海藻糖具有三种旋光异构体，分别为：α,α-1,1-，α,β-1,1-，β,β-1,1-糖苷键连接的海藻糖。在生物体中只能合成α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，所以目前所使用的和研究的大部分都是这种构象的海藻糖。

3. 研究的基本内容与计划

1.易错pcr突变文库的构建

选择合适的突变频率，构建突变文库以进行筛选。

2.热稳定性改善突变体的初步筛选

4. 研究创新点

目前，定点突变和功能域融合是提高海藻糖酶活和热稳定性的主要方法。本课题希望通过随机突变，来发掘对海藻合酶稳定性起关键作用的氨基酸。

施氏假单胞菌海藻糖合酶的序列空间为20689，在如此庞大的序列库中获得理想的突变体无异于大海捞针。易错pcr为我们在施氏假单胞菌海藻合酶的适应度景观中找到理想的序列打开了一扇门。

同时，我们还应该不断的努力获得施氏假单胞菌海藻糖合酶的结晶结构以及建立一种高通量的筛菌策略。在三维结构的指导下的理性进化将会大大缩短进化历程。具有高通量的筛菌策略将大大增加了本文中所构建的几种进化方法的效率，实现高效率进化的同时缩短了进化时间及减轻了实验者的劳动。