大肠杆菌全细胞催化L-苯丙氨酸生产苯基乳酸的研究开题报告

1. 研究目的与意义

苯基乳酸(phenyllactic acid，PLA)是一种应用广泛的手性化合物，溶解性好、易于在食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的pH范围和热稳定性，是一些重要的化学合成物前体，并广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。苯基乳酸是近年来人们发现的乳酸菌产生的一种新型抑菌物质，与Nisin等细菌素相比抑菌谱广，对革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、沙门氏菌和真核微生物如曲霉属的黑曲霉、黄曲霉，青霉属的娄地青霉、团青霉等均有抑制作用，能抑制食源性致病菌、腐败菌，特别是能抑制真菌的污染。苯基乳酸作为乳酸菌苯丙氨酸的代谢产物，对人体和动物细胞均无毒性，是一种天然生物防腐剂。相较于常见的化学防腐剂，其安全性能高，在食品工业中具有较好的应用前景,引起食品行业普遍关注。

本论文以一株共表达L-氨基酸脱氨酶、L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌为生物催化剂，利用外源蛋白诱导表达后的全细胞催化L-苯丙氨酸生产苯基乳酸。为了进一步提高苯基乳酸的产量，本实验将重组大肠杆菌全细胞催化苯丙氨酸生成苯基乳酸的条件进行了优化，并在最优的条件下进行了苯基乳酸的生产。

2. 国内外研究现状分析

2002年李光兴等以甲醇为溶剂，在70℃，3.0 mpa的情况下苯丙氨酸经raney-ni催化氢化得到β-pla的白色针状结晶，收率可以达到91，转化率91％。

2007年李兴峰等研究了利用苯丙氨酸合成苯基乳酸的过程，发现lab首先通过转氨反应将苯丙氨酸转化成苯丙酮酸，然后苯丙酮酸经还原反应生成苯基乳酸。李士龙等也证实了phe→ppa→pla途径是lab苯基乳酸生物合成核心途径的重要组成分。此外，越来越多的研究发现α-酮戊二酸也是lab苯基乳酸生物合成核心途径的一部分。李兴峰等对影响苯基乳酸合成途径中转氨反应的因素进行研究，确定氨基受体α-酮戊二酸是转氨反应的主要影响因素，只有苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同作用才可完成转氨反应。相似的发现存在于pudik和lolkema的研究中，即α-酮戊二酸是lab苯基乳酸合成的关键因素，较高浓度的α-酮戊二酸有助于pla的生成。所以lab苯基乳酸生物合成的核心途径是指lab发酵苯丙氨酸和α-酮戊二酸生成苯基乳酸的过程。

2009年沐万孟等用渗透剂乙醚体积分数为2%，渗透时间2min，渗透化温度为30℃。渗透化后细胞的最适ph值为5.0-7.0，最适反应温度是30-45℃，提高了细胞的耐热性和ph的使用范围。在温度为40℃，ph为6.0的条件下反应，底物浓度达到5g/l时，转化时间为4h，苯基乳酸的产量达到3.38g/l。渗透化细胞三次转化，以此建立一株乳酸菌渗透化生产苯基乳酸的工艺。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

1.建立实验必须的分析方法

2.全细胞催化条件的优化

4. 研究创新点

本实验利用之前构建好的能够异源共表达L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的重组菌株进行全细胞催化苯丙氨酸合成苯基乳酸，实现了以苯丙氨酸为底物节省成本的问题；生成的苯基乳酸产量高、光学纯度高，解决了天然乳酸菌生产苯乳酸产量低的问题。