利用低聚木糖废渣产海藻糖的研究开题报告

全文总字数：7522字

1. 研究目的与意义

海藻糖是一种安全的天然非还原性双糖，广泛分布于细菌、真菌、植物、昆虫和无脊椎动物生命体中。它作为一种生物活性物质，同时也是蛋白质、生物膜、单细胞生物以及动植物组织和器官的优质保护剂，加上自身对酸和热的高度稳定等特性，它被广泛应用于食品、医药、化妆品等精细化学品领域，商业价值倍增。各国运用现代生物技术批量合成海藻糖弥补了传统的直接从生物体中提取海藻糖的不足。在可持续发展的时代背景下，面对日益扩大的市场需求，合理利用资源，进一步开发更为廉价的原料以提高海藻糖产量在未来工业中尤为重要。

目前国内外都致力于利用转化来源广泛的木质纤维资源，以提供人们所需的产品和新能源。其中低聚木糖及其它功能性寡糖由于特性优良，在市场的需求不断增大，其产业规模迅速扩张，木质纤维资源不断消耗的同时也产生大量的低聚木糖废渣。这些废渣主要是玉米芯经碱抽提木聚糖后剩下的固体残渣，其中含有大量纤维素和少量的半纤维素及木质素。它们或焚烧或填埋，得不到充分利用，造成浪费的同时也污染环境。因此，低聚木糖生产废渣等农林废弃资源的高效转化与综合利用，是当下解决企业困扰和环境问题的有效途径。

本次研究利用低聚木糖废渣生产海藻糖，不仅减少了废渣的积累，还有效节约了木质纤维资源，更解决了海藻糖的原料问题，为海藻糖工业化找到了出路，可谓一举多得。大肠杆菌易于进行分子生物学的操作，可通过代谢工程途径构建基因工程菌，且繁殖快，营养要求粗放，易于培养可利用包括木糖在内的各种糖。实验室前期已通过基因工程手段构建了一株可利用纤维二糖的重组大肠杆菌BL21(pETDuet-otsA-otsB,pRSFDuet-galU-cep94)。在此基础上，具体通过纤维素酶将低聚木糖废渣中的纤维素降解为纤维二糖，利用重组大肠杆菌催化水解产物生产海藻糖，从而实现低聚木糖生产废渣的有效利用。

2. 国内外研究现状分析

2.1 海藻糖

2.1.1 海藻糖的理化性质

海藻糖（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside），是一种安全、可靠的天然糖类，是由两个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成的非还原性二糖。1832年Wiggers等人首次从黑麦的麦角菌中发现了该糖^[1]。之后发现海藻糖广泛分布于自然界中细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内,特别是在那些能抗脱水作用的生物中起着重要作用，这些特殊生物具有在脱水条件下存活多年的性质。它的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁2H₂O，存在三种不同的正位异构体(Anomers) ^[2] ，即α,α-海藻糖(又叫蘑菇糖,Mycose)，α,β-海藻糖(新海藻糖,Neotrehalose)，β,β-海藻糖(异海藻糖,Isotrehalose) 。但迄今为止，从生物体中只分离到了α,α -海藻糖^[1-2]。含两分子结晶水的结晶海藻糖加热至至 130℃时失去结晶水可成为不含结晶水的无水海藻糖。海藻糖含水分子量378.33，结晶海藻糖的密度为1.512 g/cm³，熔点为97℃，失水温度为130℃，溶解热为57.8 kJ/mol。它在5%水溶液中的旋光度为[α]D20 199。海藻糖易溶于水、热乙醇、冰醋酸，不溶于乙醚、丙酮^[3]。海藻糖在水中的溶解度随温度变化较为明显。海藻糖的甜度相当于蔗糖的45％，口味独特，食用后口中不留有后味。海藻糖具体拥有以下三种性质：（1）海藻糖安全稳定，因其缺乏游离醛基不具有还原性，不能使斐林试剂变色。它对热和酸碱都具有非常好的稳定性，能与氨基酸、蛋白质共存，不发生美拉德反应。（2）海藻糖具有较高的玻璃化转变温度，它区别于其他的二糖的玻璃化转变温度可达115℃。当海藻糖加入到其它的食品中时，更易形成玻璃态。在水溶液中，海藻糖可以保持玻璃态并形成非吸湿玻璃态，使海藻糖在结晶时保持稳定。（3）低吸湿性是海藻糖的又一特性，即使将海藻糖放置在相对湿度90％以上的地方超过1个月，海藻糖也几乎不会吸湿，有效延长产品的保质期。

图1 海藻糖结构式

Figure 1 Structure of trehalose

2.1.2 海藻糖的功能特性

海藻糖作为生物体对抗环境胁迫的重要应激保护物质，在科学界被誉为生命之糖。其独特之处就在于海藻糖对生物大分子和生物体具有神奇的非特异性保护作用，具体表现为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而 维持生命体的生命过程和生物特征。某些物种对外界恶劣环境表现出非凡抗逆性，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系^[4-5]。海藻糖相比氨基酸、甘油等对生物大分子的保护作用而言，抗脱水抗干燥方面的作用是尤为显著。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。同时，海藻糖还能用于保护生物体内DNA分子防止放射线引起的损伤^[8]。外源性的海藻糖对生物体也具有非特异性保护作用，表现为强力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的功能 ^[5-6]。水化状态的海藻糖同样对细胞，酶等活性物质具有保护作用。海藻糖因此特性可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂，还在保持细胞活性、保湿类化妆品甚至食品防腐、提升食品品质方面具有重要作用。

2.2 海藻糖的合成途径

CNKI数据显示，海藻糖合成与代谢在不同生物中采用不同的途径，不同的的营养及环境刺激可以引发不同的合成途径。从植物到无脊椎动物，海藻糖的合成途径并不完全相同。迄今为止，已报道了5条合成途径，但未见脊椎动物合成海藻糖的报道。现有途径包括otsA/otsB（trehalose-6-phosphatesynthase/trehalose-6-phosphate phosphatase）、TreS（trehalose synthase）、TreY/TreZ（maltooligosyl trehalosesynthase/ maltooligosyl trehalose trehalohydrolase）、TreP（trehalose phosphorylase）和 TreT（trehaloseglycosyltransferring synthase），此5种不同的海藻糖合成途径被广泛研究^[7-8]。

图2 不同生物中海藻糖合成与代谢途径

2.2.1 otsA/otsB合成途径

此途径广泛存在于所有原核生物和真核生物中，是唯一有T-6-P 生成的途径，也是植物中合成海藻糖的唯一途径。通过两步酶促反应完成，分别由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-P synthase, otsA)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-P phosphatase, otsB)催化，两酶分别由otsA和otsB编码。在otsA作用下尿苷二磷酸葡萄糖(UDP glucose, UDPG)和葡萄糖-6-磷酸(glucose6-phosphate, G-6-P)发生反应生成T-6-P和尿苷二磷酸 (UDP)，再由otsB酶催化 T-6-P 反应生成海藻糖和无机磷酸(inorganic phosphate, Pi) ^[9,11]。

2.2.2 TreY-TreZ合成途径

海藻糖第2条合成途径是日本人于1993年首次在一种嗜超高温古细菌硫矿硫化叶菌（sulfolobus solfataricus）KM1中发现。它将麦芽糖糊精转化为海藻糖，也由2步酶促反应完成。首先在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalosesynthase, TreY)的催化下发生糖基转移，即将麦芽糖糊精链最后一个还原性葡萄糖的α,α -1,4-转化成α,α -1,1-糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖，其末端含有1个海藻糖集团。接下来在麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (maltooligosyl trehalosetrehalohydrolase, TreZ)的催化下释放一分子海藻糖^[12]。该途径不依赖于磷酸化，对于海藻糖生物合成是一个具有应用价值的新途径^[13]。

2.2.3 TreS合成途径

这是海藻糖在生物体中的第3条合成途径，此过程在海藻糖合酶(trehalose synthase, TreS)作用下，麦芽糖中的α,α1,4-糖苷键通过分子内重排异构化成α,α -1,1-糖苷键，形成海藻糖^[5]。最初是在脂肪杆菌（Pimelobacter sp. R48）和水生栖热菌（Thermusaquaticus）两株菌中发现的，到目前为止只在真细菌中发现该途径^[14]。

2.3 海藻糖的制备

海藻糖生产目的是为了获得高纯度海藻糖产品以及相关酶产品^[18]。之前化学合成法2,3,4,6-四乙酰基葡萄糖和3,4,6-三乙酰-1,2-脱水-D-葡萄糖之间产生环氧乙烷加成生成。此法产率过低，成本高昂，无法进行工业化应用^[19]。因此，海藻糖的制备方法目前主要包括微生物提取法、微生物发酵法、酶合成法、基因工程法。

2.3.1 微生物提取法

微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物为提取源通过发酵优化等提取出海藻糖。其工艺流程一般是：活性干酵母-提取-冷却-离心-上清液浓缩去醇-去离子和蛋白-浓缩-结晶-过滤-干燥-成品。早期商品化的海藻糖是从酵母中提取的，先培养酵母菌株到对数生长期，再调控酵母菌培养条件，使酵母细胞处于饥饿状态（降低碳源、氮源）或胁迫环境(高温、高渗透压、干燥和冷冻)。体内海藻糖的含量明显增加，可达细胞干重的20%，然后利用乙醇等有机溶剂从酵母菌中抽提纯化海藻糖^[20-21]。酿酒酵母作为传统的生产海藻糖 的菌株，具有在特定的生理条件下海藻糖的含量能达到细胞干重的10%^[4]的优势，但效率偏低。经过努力，安宁^[5]将酵母诱变后通过一系列的优化，海藻糖的产量达到了5.4 g/L。韩少卿等使用膜装置对机体内海藻糖进行分离提取，海藻糖提取率达到85%以上，纯度在99%以上^[22]。

2.3.2 微生物发酵法

微生物发酵法是利发酵液进行分离纯化精制得到海藻糖。发酵法主要步骤是通过采用诱变、细胞融合或基因重组等方法培育出高产海藻糖的菌株，采用高浓度的培养基及高渗发酵，最后可得到含海藻糖高的产物。目前可利用的微生物主要包括酵母、革兰氏阳性菌，特别是微球菌属^[23]。这种方法由于微生物生长旺、繁殖快，易于培养，具有先天的优越性，结合全细胞催化的方法，可以有效降低杂质的含量，同时利用微生物细胞的代谢可以几乎完全去除底物，有利于提高海藻糖的纯度，因此是一个潜在的可以获得高纯度海藻糖的方法。

2.3.3 酶转化法

酶合成法制备海藻糖主要是以葡萄糖、麦芽糖或者淀粉为底物，通过与海藻糖合成有关的酶的作用，催化转化为海藻糖。不同底物与不同菌种海藻糖合酶反应海藻糖得率有差异。据报道，以栖热水生菌海藻糖合成酶产率最高，收率可以达到80％以上^[24]。各国投入人力物力在这方面进行大量研究，争先开拓市场前景。黄英等^[24]在E.coli中克隆表达了玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因，使用这种海藻糖合成酶可以实现 85%的转化率，缺点是产品不纯，反应温度低酶易失活。由于磷酸化酶不稳定且需要消耗高能物质尿苷二磷酸（UDP）或高浓度磷酸盐等，不适用于大规模的工业化生产，仅1998年日本有过商业化生产的报道^[25]。目前双酶法以直链淀粉为底物，通过两种酶的反复反应最终形成海藻糖。2000年，南宁中诺生物工程有限责任公司成功开发出酶法转化木薯淀粉生产海藻糖的工艺，使我国成为世界上第二个酶法工业化生产海藻糖的国家。 工业上常用脱支酶进行淀粉初步水解为双酶法提供底物。在该反应中糖基转移酶催化麦芽寡糖向糖基化海藻糖转化，产生具有糖苷键的葡糖基海藻糖，淀粉酶催化葡糖基海藻糖水解为海藻糖，转化率高达80%^[26]。

2.3.4 基因工程法

利用基因工程技术将海藻糖合成酶基因导入植物或微生物中，从而利用工程菌株或具有生产海藻糖能力的转基因植物生产海藻糖。利用基因重组法通过在E.coli中过表达海藻糖合成的酶，结合全细胞催化合成海藻糖，利用E.coli细胞的代谢将底物葡萄糖完全消耗，从而获得纯度较高的海藻糖产品，是一个潜在的获得海藻糖高纯度产品的方法。L Padilla等人在谷氨酸帮杆菌中过表达来源于E.coli的海藻糖合成酶otsBA基因的同时，过表达E.coli的UDP-葡萄糖磯酸化酶（galU），使得海藻糖的产量提高了6倍。目前比较成熟的基因工程技术是美国Calgene公司与英国Quadrant公司，两家公司联合研究利用大肠杆菌基因工程发酵生产海藻糖。近年来，植物基因重组技术得到了广泛的应用，我国张树珍等从担子菌灰树花中克隆海藻糖合酶基因并导入甘蔗，从而使甘蔗具有更长的保质期且风味较之前更好^[28]。美国Calgene 公司把一组能够将葡萄糖转化成海藻糖的基因通过间接的方法导入到富含葡萄糖的植物中，得到重组植物可以积累海藻糖。荷兰的 Mogen与Vander公司将大肠杆菌合成海藻糖的基因ots A和ots B导入马铃薯、甜菜等农作物中提高其积累海藻糖的能力，同时提高了植物的耐寒抗旱能力^[26]。现代工业生产中也常常使用基因工程法与酶转化法结合。利用基因工程技术生产海藻糖具有很大的优势。目前发现的能产海藻糖的微生物有很多，同时也发现了不同的生物合成途径和相关的酶。

表1 合成海藻糖相关菌株

类别 名称
酵母菌类	酿酒酵母 裂殖酵母 耐寒性酵母
杆菌属	谷氨酸棒状杆菌 结核杆菌 恶臭假单孢菌 丙酸杆菌
球菌属	浑浊红球菌 耐辐射球菌
嗜热菌株	嗜热栖热菌 红色亚栖热菌 高温单胞菌 耐超高温热棒菌 硫矿硫化叶菌 热球菌
嗜极菌	嗜酸菌

FrancoisJ M等^[20]重点研究探讨了Saccharomyces cerevisiae中与海藻糖合成有关基因调控机制，对酵母细胞内海藻糖提取工艺进行一定程度的优化。Mary Jackson等研究了Mycobacterium tuberculosis中海藻糖合成代谢机制^[24]，得到有效生产海藻糖的改良型突变株。

2.4 低聚木糖

2.4.1 低聚木糖的生产

低聚木糖（Xylooligosaccharide，XO），也称木寡糖，是由2-10个木糖以β-1,4-糖苷键连接而成的低度聚合糖类，是一种由木聚糖部分水解而得的低度聚合物^[13]。酶法制备的低聚木糖以木二糖和木三糖为主。在自然界中，竹笋、水果、蔬菜等少数天然植物中含有少量的低聚木糖，低聚木糖的生产一般以富含木聚糖的农业废料如玉米芯、蔗渣、棉籽壳、竹笋壳、麸皮及农作物秸秆等为原料，尤其以玉米芯为主^[27]。它的理化性质稳定，耐酸、耐热，具有很强增殖肠道益生菌，改善肠道微生态环境等功能。近年来，欧美等发达国家致力于新型低聚木糖保健食品，已广泛应用于食品、饲料、医药等领域。其中日本对低聚木糖的研究已有20多年，居世界领先水平。低聚木糖的制备方法一般分为酸水解法、热水抽提法、酶水解法、微波降解法。

2.4.2 低聚木糖生产废渣的应用

低聚木糖生产废渣( Xylooligosaccarides producing solid waste，XPSW)是低聚木糖生产产生的固体废弃物，为玉米芯经汽爆、木聚糖酶水解、过滤后所得固体残渣，具有量大、集中、无毒、价廉等特点^[24]，通常作为锅炉燃料用于提供工厂热能。主要成分为大量纤维素和少量的半纤维素及木质素。其中半纤维素的衍生物主要是半纤维素水解生成糖和糖降解产物，纤维素衍生物主要是纤维素低聚糖、葡萄糖和糖降解产物，木质素降解物主要是一些含苯环的化合物。木质纤维素类生物质水解液目前主要用于乙醇发酵、丁醇发酵、制取微生物油脂、生产木糖醇、合成乳酸和琥珀酸及饲料酵母和单细胞蛋白等^[28]。如今玉米芯的技术开发主要集中在利用其中的半纤维素资源生产木糖、木糖醇和低聚木糖，纤维素酶解液的利用有限，虽然也生产过纤维低聚糖、乳酸、乙醇等，但距离工业化应用还有一定的距。而大量的生产废渣作为一类农业纤维废弃物，多以焚烧或填埋方式处理，资源利用不够充分。利用低聚木糖废渣生产海藻糖是一种新途径，具有较好的经济效益和社会效益。

3. 研究的基本内容与计划

3.1 研究内容

1. 分析低聚木糖生产废渣的成分并选取洗涤方式

首先运用红外湿度测定仪、nrel等测定低聚木糖废渣的成分，之后选择不同洗涤方式处理低聚木糖废渣，确定最佳的洗涤方式。

2. 利用纤维素酶酶解低聚木糖废渣

4. 研究创新点

本次研究通过全细胞催化的方式处理低聚木糖废渣酶解液制备海藻糖。我们首次利用低聚木糖废渣这种木质纤维资源进行海藻糖合成。首先通过对低聚木糖废渣的预处理和酶解，得到含有大量纤维二糖和葡萄糖的酶解液。在此基础之上，实验室通过重组大肠杆菌BL21(pETDuet-otsA-otsB,pRSFDuet-galU-cep94)利用低聚木糖废渣酶解液生成海藻糖。这是我们利用低聚木糖废渣酶解液合成海藻糖的探索，实现了低聚木糖废渣的再利用。