1. 研究目的与意义
研究背景：
1、分支杆菌属：
分枝杆菌属（mycobacterium）是一类细长略弯曲的细菌属，有时有分枝或出现丝状体。在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌种，对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类，分枝杆菌属于含分枝菌酸类。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。
分支杆菌是一类革兰阳性的细菌，广泛存在于土壤和水体中。这些细菌代谢能力丰富，可以分解多种有机物质。分支杆菌通过利用可溶性脂质转移酶（soluble diacylglycerol transferase，sdt）将固定脂肪酸化为三酰甘油来获得能量并存储能量。其中一个关键的酶是ksha，它催化了脂肪酰coa的去饱和反应。另外一个重要的酶是kshb，它是一种具有特异性的脂肪酸转移酶，可以将长链脂肪酰coa转化为α-酮基酰脱羧酶（α-ketothiolase）作为β-氧化途径的起点。
2、3-甾酮-9α-羟基化酶(ksh)：
该酶由ksha和kshb两个亚基构成。
（1）ksha（9α-oh-ad）：
9α-oh-ad作为甾药合成工业中的一种极为重要的前提物质，市场前景广阔。由于其分子中9α-羟基结构的存在，合成极为困难，如何在甾体分子的9α位引入羟基，是目前合成9α-oh-ad 的主要困难所在。在9α-oh-ad的工业化生产中，主要有化学法和生物转化法，由于化学合成的局限性太大，已经逐渐被淘汰，目前主要使用微生物转化法。
（2）kshb：
ksh酶作为一个双组份酶，ksha 酶的活性需要辅基 kshb 的电子供给。kshb 作为一个还原性辅酶，不同于ksha单一的9α-羟基化能力，kshb不只可以为ksha 提供还原力，同时也参与微生物体中其他的各种反应，起到了极为重要的作用。kshb 的表达是构建具有高9α-羟基化能力大肠杆菌工程菌株中的极为重要的一环。
研究背景：
1、分支杆菌属：
分枝杆菌属（mycobacterium）是一类细长略弯曲的细菌属，有时有分枝或出现丝状体。在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌种，对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类，分枝杆菌属于含分枝菌酸类。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。
分支杆菌是一类革兰阳性的细菌，广泛存在于土壤和水体中。这些细菌代谢能力丰富，可以分解多种有机物质。分支杆菌通过利用可溶性脂质转移酶（soluble diacylglycerol transferase，sdt）将固定脂肪酸化为三酰甘油来获得能量并存储能量。其中一个关键的酶是ksha，它催化了脂肪酰coa的去饱和反应。另外一个重要的酶是kshb，它是一种具有特异性的脂肪酸转移酶，可以将长链脂肪酰coa转化为α-酮基酰脱羧酶（α-ketothiolase）作为β-氧化途径的起点。
2、3-甾酮-9α-羟基化酶(ksh)：
该酶由ksha和kshb两个亚基构成。
（1）ksha（9α-oh-ad）：
9α-oh-ad作为甾药合成工业中的一种极为重要的前提物质，市场前景广阔。由于其分子中9α-羟基结构的存在，合成极为困难，如何在甾体分子的9α位引入羟基，是目前合成9α-oh-ad 的主要困难所在。在9α-oh-ad的工业化生产中，主要有化学法和生物转化法，由于化学合成的局限性太大，已经逐渐被淘汰，目前主要使用微生物转化法。
（2）kshb：
ksh酶作为一个双组份酶，ksha 酶的活性需要辅基 kshb 的电子供给。kshb 作为一个还原性辅酶，不同于ksha单一的9α-羟基化能力，kshb不只可以为ksha 提供还原力，同时也参与微生物体中其他的各种反应，起到了极为重要的作用。kshb 的表达是构建具有高9α-羟基化能力大肠杆菌工程菌株中的极为重要的一环。
研究目的：
研究目的：
利用分支杆菌属的3-甾酮-9α-羟基化酶(ksh)研究ksha亚基与kshb亚基的结合方式以及探究最佳结合方式。
研究意义：
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
分支杆菌是一种常见的细菌，其中ksha和kshb是该菌中重要的两个基因。这两个基因编码了分支杆菌的甾体9位羟化酶。研究表明，ksha和kshb可以相互结合形成复合物，从而提高酶的催化效率。
关于ksha和kshb相互结合的研究内容包括以下几个方面：
3. 研究的方法与步骤
研究方法：
研究分支杆菌ksha与kshb的结合，采用以下两种方法：
1、同源建模：通过swiss-model和rosettafold等在线服务器建立二者的模型，并进行分析比较。
4. 参考文献
参考文献：
[1]aono r, tsukahara k, miyazaki m, et al. crystallization and preliminary x-ray diffraction studies of a cytochrome p450 from a naphthalene-degrading bacterium, pseudomonas sp. strain ncib 9816-4. acta crystallogr d biol crystallogr. 2003;59(p):1315-1317.
[2]austin rn, mchugh te, zhang x, et al. characterization of the mycobacterium tuberculosis cytochrome p450 system: functional expression of cyp121 and identification of its physiological substrate. j biol chem. 2008;283(52):33498-33508.
5. 计划与进度安排
1）2024-12～2024-02：查阅文献资料，撰写开题报告。
2）2024-02～2024-03：完成模型构建和确定ksha与kshb的最优结合位置。
3）2024-03～2024-04：通过虚拟突变分析两者结合情况，获得结合效果更佳的ksh。
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