木糖导向的定向分子改造OsRpiB研究开题报告

1. 研究目的与意义

稀有糖是单糖及其衍生物，在自然界中很少见。由于稀有糖的生理功能结构，稀有糖被广泛地用作食品添加剂，如：甜味剂和具有生物活性的分子构建模块。例如，D-木酮糖可用于合成支链戊糖、氨基糖、糖苷、寡糖和抗生素，D-核酮糖可用于制备抗肿瘤、抗病毒和抗癌药物。通过酶途径制备稀有糖已经进行了深入的研究，最常用的工具是糖异构酶。例如，D-核糖可以分别由D-阿拉伯糖异构酶催化的D-阿拉伯糖、D-塔格糖-3-差向异构酶(DTE)催化的D-木酮糖和D-核糖-5-磷酸异构酶B(RpiB)催化的D-核糖制备。然而，在这些方法中使用的糖异构酶通常催化昂贵的底物，导致相对低的反应成本效益。
一个潜在的解决方案是整合异构酶催化的反应组成酶级联，使制备反应能够从廉价底物开始，如D-半乳糖、D-果糖和乳糖。由于可调糖异构酶的底物混杂性，这些级联平台可制备多种稀有糖。值得注意的是，丰富的生物质中含有大量的单糖，其中大量的D-木糖是木质纤维素糖化过程中的主要副产物。目前，大部分生物质D-木糖被化学转化为低附加值分子，其中木糖醇纯度不理想，已占据全球多元醇市场的15%左右。以及其他五种碳化学品，如5-羟基-甲基糠醛(HMF)。因此，迫切需要从D-木糖开始的更多样化的生物炼制路线。代谢工程改造了酿酒酵母和其他微生物，从D-木糖生产2G乙醇和高附加值的合成生物产品，然而，与D-木糖相比，微生物更容易利用D-葡萄糖，并且细胞生长消耗了大部分D-木糖，导致发酵策略中的低原子效率和工艺经济性。

本课题基于课题组已有具有独特底物特异性的苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）核糖-5-磷酸异构酶B（Ribose-5-phosphate isomerase B, OsRpiB），拟采用易错PCR方法对其木糖活性进行增强。利用易错PCR方法进行多轮迭代突变，以D-木糖为唯一碳源或主要碳源进行平板筛选，以获得高活性的OsRpiB突变体。

2. 研究内容和预期目标

研究内容

木糖是重要的生物质单糖，对其进行转化具有显著的环境和经济意义。本研究基于课题组已有具有独特底物特异性的苍白杆菌（ochrobactrum sp.）核糖-5-磷酸异构酶b（ribose-5-phosphate isomerase, osrpib），拟采用易错pcr方法对其木糖活性进行增强。利用易错pcr方法进行多轮迭代突变，以d-木糖为唯一碳源或主要碳源进行平板筛选，以获得高活性的osrpib突变体。

预期目标

3. 研究的方法与步骤

1） 大肠杆菌培养及分子生物学操作。大肠杆菌连接转化和培养条件：pcr扩增产物琼脂糖凝胶中电泳检测后利用试剂盒进行回收，从e. coli dh5α中提取pet-28a质粒，酶切后纯化的载体和目的基因混合后加入多片段重组连接酶在30oc反应1 h，重组连接体系为（5ce multis buffer 4 μl，exnasemultis 2 μl，目的基因片段各1.5 μl，线性化质粒10 μl，双蒸水2.5 μl）；连接产物4oc保存。转化：将重组质粒加入感受态中，冰上放置30 min，42oc水浴热激90 s后冰上放置2 min，加入400 μl 不含卡那霉素抗性的lb培养液，37oc培养1 h后，取100 μl菌液于含有卡那霉素抗性的lb平板上涂布过夜培养。

2） 木糖活性测定条件：木糖浓度为10 mm，osrpib酶液加入质量比为10%（蛋白/底物），在ph 7.5 tris-hcl缓冲溶液，55 oc，1 ml体系下下进行反应，采用半胱氨酸咔唑法监测反应过程，高效液相色谱法进行验证。

3） hplc检测方法：反应样品在100 oc下水浴灭活5 min，离心（15000 r/min，10 min），然后通过0.22 μm膜过滤。上清液通过配备sugar-paktm色谱柱（6.5300 mm，waters）和折光率检测器的agilent 1120 hplc进行测试，然后在80oc下用0.3 ml/min的超纯水洗脱。

4. 参考文献

[1] 李路,张贵生.稀有糖的合成方法研究[j].有机化学,2008,28(7):1129-1137.

[2] izumori k. bioproduction strategies for rare hexose sugars[j]. die naturwissenschaften, 2002，89(3): 120-124.

[3] zhang rg, andersson ce, skarina t, et al. the 2. 2 resolution structure of rpib /alsb from escherichia coli illustrates a new approach to the ribose-5-phosphate isomerase reaction[j]．j mol biol, 2003, 332(5):1083-1094.

5. 计划与进度安排

1）2024-12～2024-02：查阅文献资料，撰写开题报告。

2）2024-02～2024-03：osrpib的随机突变和筛选。