复合诱变筛选蜡样芽孢杆菌Thr-菌株的研究开题报告

1. 研究目的与意义

蛋氨酸（methionine; met）甲硫氨酸，又可以叫做甲硫基丁氨酸，其化学名为α- 氨基-γ-甲硫基丁酸，相对分子质量为149.21，是一种非极性α-氨基酸，并且它是非极性α-氨基酸中唯一一种含有硫元素的。蛋氨酸固体正常有两种形态，白色薄片状晶体或者白色粉末状晶体。其有特殊气味，味微甜，熔点为280~281 ℃，相对密度为1.34kg/m3。蛋氨酸是人体的必需氨基酸之一，它不能在体内合成，需要从外界获得。蛋氨酸是一种具有旋光性的化合物，分为l-蛋氨酸和d-蛋氨酸，两者为手性异构体。其中，l-蛋氨酸可以直接被人体利用，而d-蛋氨酸在人体内被转化为l-蛋氨酸之后才会被人体所利用。l-蛋氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，也是s-腺苷甲硫氨酸、多胺以及生物素等细胞中重要代谢物质的前体。

用于动物营养的蛋氨酸有3 种来源：l-蛋氨酸(l-met)、dl- 蛋氨酸 (dl-met) 和羟基蛋氨酸(oh-met)。蛋氨酸除了是蛋白质的重要组成部分，它还通过合成s-腺苷甲硫氨酸(sam)间接参与调控细胞中的各种生理生化反应，如：细胞分裂以及细胞壁和细胞膜的形成等过程。l-蛋氨酸在肠道中发挥出更好的生物学功能。

蛋氨酸在饲料工业，医药工业，化学工业方面都有很多应用。在饲料工业方面，蛋氨酸作为一种蛋白质氨基酸，是机体中合成sam的甲基的供体，所以它也是是动物饲料里一种必需的添加剂，添加了蛋氨酸的动物饲料可以在短时间内帮助动物快速成长，从而节省了大量的饲料，缩短畜牧业的养殖周期。而在禽类的配合饲料中,蛋氨酸则是第一限制氨基酸。当鸡鸭鹅等禽类缺乏蛋氨酸时，会出现体重减轻，发育不良,肝肾机能减弱,皮毛变质等症状。饲料中除了直接添加d构型和l构型的蛋氨酸之外，羟基蛋氨酸、羟基蛋氨酸钙盐、n－羟甲基蛋氨酸等也常作为饲料中的添加剂。蛋氨酸在饲料中的重要地位，使得饲料添加剂在蛋氨酸消费结构中所占的比重最大，也就是说蛋氨酸工业化生产的主要市场面向饲料添加剂的。在医药工业中，蛋氨酸作为人体必需氨基酸，与生物体内许多含硫化合物的新陈代谢有关，比如维生素b1，辅酶a等。当机体缺少蛋氨酸时，会出现食欲减退，体重减轻，生长减缓等症状，有关蛋氨酸缺乏所造成的疾病有毒血症，童年风湿热，肌肉麻痹，头发损失，抑郁症，精神分裂症，帕金森氏病，肝恶化等。至于一些罕见的蛋氨酸遗传缺陷病，如胱氨酸尿症和高甲硫胺酸血症，会引起智力低下，发育停滞，血小板减少，听力缺陷，这正是由于蛋白质调节机制无法正常作用而使得机体内蛋氨酸含量快速上升带来的后果。

2. 研究内容和预期目标

现有国内外制备蛋氨酸的方法主要是化学法，但是化学法污染大、成本高。而发酵法制备蛋氨酸相对安全，但产量极低。如何获得获得蛋氨酸高产菌株是本课题研究主要内容，主要从菌株诱变条件优化、菌株筛选方法、蛋氨酸测定方法、培养条件优化方法等方面分析。实验用的蜡样芽孢杆菌是实验室自己筛选、经过基因工程的菌株。筛选、改造此菌株时的目的是获得蛋氨酸高产菌，从产物检测结果分析，thr的产量也比较高。thr是蛋氨酸产生代谢通路上的支路，会减少向蛋氨酸代谢方向的流通。本课题的目的是，通过物理化学诱变剂对蜡样芽孢杆菌诱变，经大量筛选，获得thr缺陷型菌株。

研究内容

1) 完成一篇外文文献的翻译（5000字以上）；查阅多篇参考文献，至少10篇，外文至少2篇；

3. 研究的方法与步骤

1) 蛋氨酸概述 从蛋氨酸的结构、功能和产量等方面对蛋氨酸的基本情况进行描述。比较化学法与发酵法生产蛋氨酸的优缺点，并对发酵法生产蛋氨酸的现状进行分析。

2) 对已选菌株采用复合诱变 介绍蜡样芽孢杆菌的特点和培育高产蛋氨酸菌株的代谢机制和原理，然后介绍复合诱变的方法原理以及相应操作流程和注意事项，接着介绍亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线等几种诱变剂的性能及其在本实验中发挥的作用。从筛选lys-营养缺陷型菌株得到高产蛋氨酸菌株的机制介绍蛋氨酸的生产现状。

3) 检查诱变结果及菌种培养条件优化 检查复合诱变的结果，筛选出并富集培养诱变成功的赖氨酸缺陷型菌株。同时，不断优化培养基成分、优化培养条件以及尝试在培养基中加入前体的方法，多次进行发酵培养，通过相关的实验数据研究最优化培养条件。

4. 参考文献

[1]niu k, xu y y, wu w j, et al..effect of dissolved oxygen on l -methionineproduction from glycerol by escherichia coli w3110bl using metabolic fluxanalysis method[j]. journal of industrial microbiology biotechnology,2020, 47(3):287-297.

[2]chen h l , zhu n q, wang y , et al.. increasing glycolysis by deletion of kcs1and arg82 improved s-adenosyl-l-methionine production in saccharomycescerevisiae[j]. amb express, 2021, 11(1):1-16.

[3]tang x l , du x y , chen l j , et al.. enhanced production of l-methionine inengineered escherichia coli with efficient supply of one carbon unit[j].biotechnology letters, 2019, 42(1):429-436.

5. 计划与进度安排

1)2022-2022-1学期第17-19周-2022-2022-2学期第4周（2022.12.28-2022.03.28）完成翻译，菌株活化，建立诱变流程，开题报告编写；

2)第5-7周（2022.03.29-2022.04.18）诱变预实验，正式试验，采用亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线等复合诱变；

3)第8-9周（2022.04.19-2022.05.02）筛选获得thr缺陷型；做3轮以上实验，验证是否是thr缺陷型；