1. 研究目的与意义
背景
金针菇（flammulina velutipes）属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属，是著名的食、药兼用真菌，不仅味道鲜美营养价值高，而且含有多种生物活性物质，是目前国内人工栽培较为广泛、消费量较大的食用菌类之一。研究发现，金针菇中含有丰富的多糖类物质，是其主要的活性成分之一，具有提高人体免疫力、保肝、保湿、抗感染、抗氧化、辅助改善记忆和缓解疲劳等保健作用。
关于金针菇多糖对于学习记忆方面作用的研究不多，邹宇晓等分别以雄性sd大鼠和雄性km小鼠为试验对象进行试验得出结论：金针菇多糖可有效改善氢溴酸东莨菪碱诱导的记忆障碍模型小鼠、大鼠的学习记忆能力，治疗效果优于脑复新或与之相当。可见，金针菇又被称为智力菇有一定道理，金针菇多糖对人的健脑益智作用值得深入研究。
金针菇多糖具有一定的美容功效。李守勉等通过结晶紫法测定金针菇多糖清除羟基自由基能力的试验，测得质量浓度为1％的金针菇多糖溶液清除羟基自由基的能力为5.10％。结果表明，1％金针菇多糖有一定的清除羟基自由基的能力，证实了金针菇多糖的抗氧化性能。他们还通过体内法测水合率证实了金针菇多糖溶液具有优越的保湿性能，且金针菇多糖的平均水合率大于甘油，表明金针菇多糖在皮肤角质层中结合水的能力优于甘油。多糖是由单糖连接而成的多聚物，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中。生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类.多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。溶剂法分为水提法，酸提法，碱提法，超临界流体萃取法；生物提取法多用酶解法，物理强化法也是现在运用较多的方法，有微波法和超声波较为常见。
2. 研究内容和预期目标
研究内容包括：
（1）利用单因素实验确定最佳的超声波提取次数，利用plackett－burman设计考察超声波功率、超声波处理时间、提取温度、料液比、ph等因素对多糖提取率的影响，通过模型分析找寻较重要因素。
（2）利用爬陡坡试验，以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据因素效应值大小确定变化步长，快速逼近最优区域。
3. 研究的方法与步骤
1实验前期准备工作：
（1）准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；
（2）将金针菇干料研磨成粉末；
（3）进行预实验，学习并熟练超声波法提取金针菇多糖的方法和多糖测定的方法。
（4）设计实验表格
2实验过程：
（1）研磨金针菇粉末，用60目筛子过筛获得最终金针菇粉末。
（2）确定固定的的超声波功率，提取时间，料液比，提取温度以及pH，多次提取多糖，每次提完检测其中多糖含量，确定实验提取次数。
（3）在提取次数固定情况下，设计PB试验对超声波提取金针菇多糖的各个因素进行分析：
超声波功率/w | 提取时间/min | 料液比 | 提取温度/℃ | 提取pH | |
1.00 | 600 | 40 | 1:40 | 80 | 8 |
-1.00 | 300 | 20 | 1:20 | 50 | 4 |
N=12时 Plackett－Burman设计编码水平如下：
因素 管号 | 液体pH | 超声波功率(W) | 超声波时间(min) | 温度 (℃) | 料液比 |
1 | -1(4) | 1(600) | 1(40) | -1(50) | 1(1:40) |
2 | 1(8) | 1 | -1(20) | 1(80) | 1 |
3 | 1 | -1(300) | -1 | -1 | 1 |
4 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1(1:20) |
5 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 |
6 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 |
7 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 |
8 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
9 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 |
10 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 |
11 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
12 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 |
（4）按上述表格处理金针菇多糖，获得的粗多糖提取液，测多糖得率。
（5）利用Design-expert对Plackett-Burman实验结果进行分析，筛选出影响最显著的因素。
（6）进行爬陡坡实验逼近优化区域
（7）响应面法确定最优条件,并预测多糖得率
（8）使用最优条件进行验证试验
多糖得率测法：
多糖得率测定公式：多糖得率(％)=(总糖含量-还原糖含量)/粉末质量
苯酚硫酸法
(1) 试剂的配制
0.1mg/mL葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用[8]。
5%苯酚水溶液：取苯酚5g用蒸馏水定容至100mL，配成5%苯酚水溶液(置棕色瓶，冰箱冷藏)。
(2) 葡萄糖标准曲线的制作：
取6支25mL试管编号，按下表分别加入浓度0.1mg/mL的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，冰浴的情况下分别加入0.5ml苯酚，再分别加入5ml浓硫酸，充分摇匀，沸水浴5min。再放入冰中冷却，并以0号管为空白参比测520nm处吸光值。
表1 葡萄糖标准曲线的制作（苯酚-硫酸法）
Tab1 product of standard curve of glucose（Phenol - sulfuric acid method）
管号 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
葡萄糖标准液(mL) | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
蒸馏水(mL) | 0.1 | 0.08 | 0.06 | 0.04 | 0.02 | 0 |
以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
(4)样品的总糖测定：
精密吸取稀释溶液1ml，在冰水浴中精密加入5%苯酚水溶液0.5ml、浓硫酸5mL，混匀，沸水浴2min，即时置于冷水浴冷却；另以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液进行相同的反应作为空白参比测490nm下吸光值,得出总糖含量。
3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)
(1) 试剂的配制
DNS溶液：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中1周后稳定，备用。
1mg/mL葡萄糖标准液的配制：准确称取烘干的分析纯葡萄糖1g，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后转移到1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，混合均匀，4℃冰箱中保存备用。
(2) 葡萄糖标准曲线的制备：取6支25mL试管编号，按下表分别加入浓度1mg/mL的葡萄糖标准液和蒸馏水，配成不同葡萄糖含量的反应液，再加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂2ml，沸水浴5min，待冷却后，加入9ml蒸馏水，并以0号管为空白参比测520nm处吸光值。
表2 葡萄糖标准曲线制作（DNS法）
Tab2 product of standard curve of glucose(DNS)
管号 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
葡萄糖标准液(mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
蒸馏水(mL) | 1 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
以OD值为纵坐标，葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
(4) 样品的还原糖测定：
精密吸取上清溶液1ml，精密加入DNS溶液2mL，摇匀，置沸水浴5min，取出后置于自来水冷却至室温，后加入9mL的蒸馏水，另以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液进行相同的反应为空白参比测490nm下吸光值，得出还原糖含量。4. 参考文献
[1] 郑义，李超，王乃馨. 金针菇多糖的研究进展[j]. 食品科学，2010，31（17）：425-428.
[2] 黄琼，黄晓梅，张平，等. 金针菇多糖的抗氧化活性[j]. 食品研究与开发，2014，35（4）：66-69.
[3] 贺伟强，巢新东，陈凌. 金针菇多糖生物活性及提取工艺的研究进展[j]. 食药用菌 2014,22(2)：80-83.
5. 计划与进度安排
1.1-4周：查阅文献，制定实验方案，撰写开题报告，学习软件使用；
2.5-7周：开始实验准备工作，进行预实验，熟悉实验方法；
3.8-14周：使用超声波法从金针菇子实体中提取胞内多糖，确定最佳的提取方法；
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