鲀科线粒体COII序列差异及其系统进化关系开题报告

1. 研究目的与意义

鲀科（tetraodontidae）属鲀形目下的1科，通称鲀。个别种如鲀属有些体长可达900毫米。体粗短或亚长椭圆形。头及吻宽钝。主要分布于太平洋，印度洋和大西洋热带。一般栖息在近海及咸淡水中，有些能进入江河，也有少数鲀属的种类仅生活与淡水内。为底层肉食性鱼类。性贪食，主食虾、蟹、贝类及小鱼等。食道向前腹侧及后腹侧扩大成气囊，遇敌能吸水和空气，使腹部膨胀如球，浮于水面。有16属约118种。鲀科鱼类中国产11属39种，常见的属有兔鲀属、腹刺鲀属、东方鲀属、宽吻鲀属、凹鼻鲀属、叉鼻鲀属及扁背鲀属等。

张际峰, 卢韫,杜晓光等人将太湖新银鱼与有明银鱼、小齿日本银鱼的同源序列进行比对分析,并基于线粒体coii cytb基因合并数据的核苷酸和氨基酸两种序列形式,以黑斑蛙为外群,对10种鱼类进行分子系统树的构建,结果一致表明:小齿日本银鱼与有明银鱼的亲缘关系近于太湖新银鱼;鲱科与鲑科的亲缘关系近于银鱼科鱼类;此外在本研究硬骨鱼类的4个科中,白鲟科作为原始而古老的类群,是在系统进化的过程中首先分化出来的一支。

邵爱华，朱江，史全良克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组( mtdna)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(coiii)及其下游70 bp的trnagly序列.coiii基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质.鱼类coiii的序列组成对a t核苷酸的偏倚程度比较低.通过暗纹东方鲀与genbank中8个目12种鱼类的coiii序列同源性比较, 显示暗纹东方鲀与这些鱼类的coiii基因具有较高的同源性.根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的coiii基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的trna的二级结构具有典型的三叶草型结构.根据coiii序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。

2. 研究内容和预期目标

1．免疫器官细胞基因组dna的提取。

胸腺、肾脏和脾脏是鱼类最主要的免疫器官，黏膜淋巴组织(malt)同样是其免疫系统的重要组分。

2目的片段pcr扩增，鉴定、测序。

3. 研究的方法与步骤

一、材料：

试验动物 暗纹东方鲀购自江苏省苏州市南门水产市场。选取暗纹东方鲀，活体解剖取肝脏或肌肉，用STE缓冲液漂洗后，适宜温度储存保存备用。

菌种和质粒 载体，表达载体、菌种E.coli DH5α。

主要试剂 RNAisoReagent、PrimeScrip t RT - PCRKit、5′- Full RACE Kit和3′- Full RACE Core SetKit; Gel Extraction System B、B type: mini - Plasmid Rapid Isolation Kit,; 限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ；DNase I、RNase、T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液，0.5*TBE电泳缓冲液，TAE电泳缓冲液，10×加样缓冲液，6×加样缓冲液，1000×溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，DNA分子量标准，IPTG,X-gal,SOC培养基，无菌dd water，胰化蛋白胨，酵母提取物，Nacl,NaoH,无水乙醇，2U/ul Taq DNA聚合酶，10*PCR缓冲液，0.5 ug/ul溴化乙锭溶液，dNTPs。限制性内切酶为TAKARA公司产品，Dnase I、RNaseA、Protinase K为Sigma公司产品，其他试剂均为分析纯产品。

实验器材 PCR仪，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外检测仪，超净工作台，台式离心机，冰箱，灭菌锅，1.5ml微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面离心管架，微量离心管，恒温水浴锅，电子天平，分光光度计，快速混匀器，刀片，一次性手套，恒温摇床，镊子，摇菌试管，酒精灯，试管架，记号笔，三角烧瓶，微波炉，培养皿，玻璃棒，接种环，无菌牙签，等

二、方法与步骤

1、暗纹东方鲀胸腺细胞/脾脏细胞基因组DNA的提取

取新鲜暗纹东方鲀，剥离胸腺，取100 mg胸腺组织，液氮研磨，加入1 ml的洗涤试剂，12000 g离心取上清，加入1/5体积的氯仿，振荡后4℃、12000 g离心15 min，取上清，用等体积的异丙醇沉淀，用体积分数75%的乙醇清洗，干燥后用灭菌水溶解沉淀，-80℃保存备用。参照基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作严格按试剂盒使用说明书进行。

2、引物设计、PCR 扩增

根据GenBank上已发表的同属的红鳍东方鲀的COII序列的保守位点，设计特异性引物，进行PCR反应：

3 、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段及电泳鉴定

（1）PCR结束后，取10ul产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，把凝胶EB染色10-20min，在紫外灯下观察胶上是否有预计的主要产物带。找到目的DNA 带所在的凝胶，并把它切下来，转移至一个称量过的1.5ml微量离心管中，再称量后计算胶的重量。

（2）从凝胶中回收目的DNA片段

①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

②将单一的目的DNA片段条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

③向胶块中加入3倍体积溶胶液PN：当回收的目的片段＜150bp或琼脂糖凝胶浓度＞2%时，建议使用6倍体积溶胶液PN。50℃水浴10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至溶胶块完全溶解。

④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

⑤向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW（使用前加入无水乙醇），12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

⑥向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30-60秒，倒掉废液。

⑦将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

⑧将吸附柱CA2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB（如果回收的目的片段＞10kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴热），室温放置2，min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。（为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤8）

⑨取5ul电泳鉴定，其余放入贮存于-20℃保存。

注意事项：①影响回收率和回收质量主要因素是PH值和切胶厚薄。

②切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。

4、目的基因片段与载体连接

取一个灭菌的0.2ml 微量管，按下列次序加入

Solution Ⅰ5μl

Pmd19-T载体4.5μl

纯化的PCR产物 0.5μl

上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，4℃冰箱保存过夜。

5、 感受态菌的制备

A、取一支无菌的试管，在超净工作台中加入2mL LB(不含氨苄)培养基。

B、在超低温冰柜中取出DH5α菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mL LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

C、取50uL上述菌液转移到含有5ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2-3h，测定OD520.

D、将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min离心10min。

E、将离心管倒置以倒尽上清液，加入1mL冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，立即在快速混匀器上混匀，插入冰中放置30min。

F、4℃，5000r/min离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬，插入冰中放置30min。

G、4℃，5000r/min离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl₂（含15%灭菌甘油）溶液重悬。

H、在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

6、 细菌转化

a将新鲜制备的-80℃保存的200ul感受态细胞，置于冰上，完全解冻。

b加10ul连接液，轻轻混匀。

c冰上放30min，每隔10min轻弹一次防止上冻。

d42℃热激90S。

e冰上放2-5min。

f加800ulLB培养基，37℃ 200-250rpm振荡培养1h。

室温下4000rpm离心5min，用枪头吸掉850ul上清液，剩余的培养基将细胞悬浮。

7、重组子的筛选

a用移液枪将4ul IPTG和40ul X-gal打入离心管中，混匀。

b将上液涂布在LB（含氨苄）培养皿平板上。

c将上步制备的感受态细胞150ul涂布在平板上，37℃正向放置1h后再倒置培养24h。

d在超净工作台中取灭过菌的试管，加入3ml含氨苄青霉素的LB培养基。

e观察转化产物的涂布平板和培养后的结果，用小的移液枪吸取平板培养基上的白色菌落，然后连枪头打入盛有3ml LB的摇菌试管中，37℃摇床培养过夜。

8、载体质粒DNA的小量制备

实验准备

a第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1中，4℃保存。

b准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。

c第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。

d使用前，检查B uffer S2中是否出现沉淀，应于37℃水浴加热溶解并冷却至室温后再使用。

操作步骤：

a取1.5ml在LB培养基中过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。

b加入250ul Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

c加入250ul Buffer S2，温和并充分的上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(1)加入350 Buffer S3，温和并充分的上下翻转6-8次，12000rpm离心10min。离心法纯化质粒DNA

(2)吸取步骤4中的离心上清并转移至制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

(3)将制备管置回离心管，加500ulBufferW1,12000rpm离心1min，弃滤液。

(4)将制备管置回离心管，加700ulBufferW2,12000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次，弃滤液。

(5)将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min。

(6)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备膜中央加80ulddH₂o,室温静置1min，12000rpm离心1min。

注意事项：

Buffer S2、Buffer S3、Buffer W1含刺激性化合物，操作时要带乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼镜和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼镜时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

9、载体质粒DNA的酶切

1、混合下列溶液于一个无菌的0.2ml微量离心管中：

20μl EcoR I单酶切体系 20μl EcoR I/Hind Ⅲ 双酶切体系

ddH2O 7μl ddH2O 4μl

10×EcoR I Buffer (EB) 2μl 10×Tango Buffer(TB) 4μl

重组质粒 10μl 重组质粒 10μl

EcoR I 1μl EcoR I 1μl

Hind Ⅲ1μl

2、先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶立即插入冰块中。

3、用一只手的手指捏住盛放酶的微量离心管的上部，另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1μl限制性内切酶。在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机1000rpm离心10秒。取出后插到离心管中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h。（一般是37℃）。

10、酶切产物的电泳鉴定

1. 称取0.8琼脂糖粉，放入三角瓶，假如100ml0.5×TBE电泳缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉或电炉加热直至琼脂糖溶解。2. 带上线手套，从微波炉或电炉中取出三角瓶，置桌面上冷却不烫手。3. 加样：用微量加样器将上述样品分别降入胶板的样品孔内。

4. 电泳：加完样后的凝胶板可以通电进行电泳.根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至80-100V电压或35MA下电泳。打开电源开关,样品将形成一条蓝色的横带向前移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿1cm处时，停止电泳。6. 染色、观察和拍照将电泳完成后的凝胶浸在含溴化乙锭溶液中，染色约20min，在紫外灯下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。7. 酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA对比电泳，以确认切下的片段是否为自己想要的片段。

根据酶切鉴定和PCR鉴定结果判断克隆的片段正确与否，测序。

三、 COII序列的结构预测以及系统发育分析

1. 用在线和生物学分析软件对暗纹东方鲀COII序列的结构进行预测分析和比较。收集GenBank上已有的各物种COII序列，用Clust2al X软件与暗纹东方鲀COII序列进行多序列比对，比对结果用PAUP4. 0b10构建系统发生树。用LAL IGN将暗纹东方鲀与其他物种COII序列进行两两整体比对。

4. 参考文献

[1] 肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体dna 的遗传与进化[j]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.

[2] nei m,s kumar.molecular evolution and phylogenetics [m].oxforduniversitypress,new york. 2000.

[3] 郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna 研究新进展[j]. 遗传学报,2004 , 31(9) : 983-1000.

5. 计划与进度安排

2022年11月18日---2022年1月20日：确定论文选题，与指导教师见面。查阅相关文献。

2022年1月21日---2022年2月26日：接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告；

2022年2月29日---2022年3月18日：综合相关文献资料，撰写开题报告，设计实验方案并进行预试验。