酶法制备田菁半乳甘露低聚糖的研究开题报告

全文总字数：2313字

1. 研究目的与意义

以田菁种子为原料，通过单因素实验讨论底浓、酶用量、pH、温度、时间这五个因素对酶解效果的影响，采用正交实验法优化酶解条件，找出影响酶解效果的主要控制点。

2. 国内外研究现状分析

近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人民的健康状况有所改善。但是一系列由饮食结构不合理，如脂肪摄入量过多等原因造成的高血压、糖尿病、超重、肥胖等疾病的发病率逐年增高。如何通过改善饮食结构，采用功能食品的形式来控制人体的血脂水平，以预防和控制冠心病的发生和发展, 这是全世界医药、食品、营养界关注的热点。功能性低聚糖，又称功能性寡糖（oligosaccharide），是指具有特殊生理学功能的由2～10个单糖通过糖苷键连接而成的具有直链或支链的低聚合度糖类。功能性低聚糖具有糖类某些共同的特性，可直接代替糖料，作为甜食品配料。但不被人体胃酸、胃酶降解。且在小肠中不被吸收，在大肠部位还具有促进人体双岐杆菌的增殖等生理功能。功能性低聚糖主要包括低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚甘露糖、低聚木糖、低聚壳聚糖、低聚半乳糖、纤维低聚糖、水苏糖、异麦芽酮糖、乳酮糖和低聚龙胆糖等。半乳甘露低聚糖（galactomannan-oligosaccharides，简称gmos）是低聚糖家族的新成员，广泛存在于瓜儿豆胶、 田菁胶及多种微生物细胞壁内，是半乳甘露聚糖的不完全降解产物。甘露聚糖降解酶的作用主要的甘露聚糖降解酶有β-甘露聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶。利用酶法生产甘露低聚糖的方法具有水解过程简单、产物聚合度低、纯度高的优点。β-1,4-d-甘露聚糖酶是一类能够水解含有β-1,4-d-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等)的水解内切酶，简称β-甘露聚糖酶。β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物和微生物体内都有该酶的存在。而微生物则是β-甘露聚糖酶的主要来源。已报导的有芽抱杆菌、假单胞菌、弧菌真菌中的曲霉、青霉、酵母和放线菌中的链霉菌等都是产β-甘露聚糖酶的常见菌群。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶的分子量、最适反应ph值、等电点、最适反应温度、酶动力学常数、底物专一性等都有一定的差异。由于瓜尔胶、田菁胶等主要成分为是半乳甘露聚糖，其分子结构的主链由d-甘露糖通过β-1,4-糖苷键链接而成，侧链则是不均匀地由单个d-半乳糖通过a-1,6-糖苷键链接在主链的d-甘露糖元的c6上。用β-甘露聚糖酶酶解瓜尔胶时，该酶只对主链上的β-1,4-糖苷键进行酶切，而对a-1,6-糖苷键不起作用，因此酶解产物是带有d-半乳糖侧链的小分子甘露聚糖。酶解产物的聚合度和分子量随酶的添加量和反应时间而改变，其中聚合度在2~10的酶解产物是一种具有生理功能的低聚糖或寡糖，称为半乳甘露低聚糖。a.a. klyosov等人使用数学建模的方法表征β-1,4-d-半乳甘露聚糖，使用来自里氏木霉和myceliophthora thermophila（m.嗜热菌）的β-1,4-甘露聚糖酶对理论限制比例的刺槐豆，塔拉胶和瓜尔豆胶进行水解测试。发现，t. reesei的β-甘露聚糖酶的攻击一行中含有4个和更多的未取代的吡喃甘露糖残基序列，而m.嗜热菌产的β-甘露聚糖酶攻击在一行中含有5个和更多的吡喃甘露糖基残基的序列。

半乳甘露低聚糖的制备文献中有报道利用酸酶结合法、微波-氧化法、超声波降解法等制备葡甘露低聚糖。日本福山大学的学者masahiro k等用草酸青霉菌中产的β-甘露聚糖酶，在最适温度60℃和最适ph5.0情况下制备瓜尔胶半乳甘露低聚糖，由hplc检测到聚合2~7的低聚糖，以聚合度为6和7的低聚糖为主，且产物中低聚糖含量为92%。康立新，周玉玲，马立新等人利用枯草芽孢杆菌产生的碱性甘露聚糖酶，以魔芋、槐豆胶、瓜尔胶与田菁胶为原料，制备甘露低聚糖。比较了酶对底物水解反应动力学，对低聚糖制备过程中的水解液进行了还原糖测定，并通过质谱对最终酶解液组分进行分析。结果表明：魔芋与槐豆胶为甘露聚糖酶的最适水解底物，水解8 h后，还原糖得率稳定，可作为甘露低聚糖生产的指导依据。酶解24 h后，魔芋、槐豆胶、瓜尔豆胶及田菁胶的主要产物分别为二糖至九糖、五糖至十糖、二糖至十糖和二糖至十糖。吴襟等人，利用诺卡氏菌na3-540产生的β-甘露聚糖酶（manna），对槐豆胶、瓜胶、田菁胶和魔芋胶等植物胶进行水解，其向5ml1%( w/v)植物胶中加入5ml酶液，60℃保温24h，反应结束后分别用高压液相分析法和硅胶板层析色谱法检测器水解产物；测定生成的还原糖量并用酸水解法测定总糖量，算出其最终水解率。发现田菁胶的水解率可达55.8%。周永治用l16( 54) 正交方式对酶法制备半乳甘露聚糖进行工艺条件的筛选。各因素对还原性糖基得率影响的顺序为：时间>温度>底物浓度>酶量> ph值。优化的工艺条件为：反应时间8. 0h，反应温度65℃，底物浓度2. 0%，酶量20u/ g，ph值7. 0。实验以最优组合进行酶解试验，重复3次，测得还原性末端糖基得率平均值为17. 85%，平均聚合度为5. 6。杨洋等利用β-甘露聚糖酶对皂荚多糖胶进行解聚改性。通过初期补料方式提高底物浓度，在反应24 h后10 0g/ l和150g /l的反应液中还原性末端糖基得率分别为50.89%和46.97%。酶解产物的平均聚合度为2.0 0。皂荚多糖胶的酶解产物主要为甘露四糖(17. 25%)、甘露三糖(28.68%)、甘露二糖(4.55%)，水解产生的单糖仅为 1.81%。

小结：我国对半乳甘露聚糖的研究从20世纪70年代才起步。甘露低聚糖作为低聚糖中的佼佼者，对提高机体免疫能力，提高肠道抗真菌活性等方面有突出的作用。因此进行半乳甘露低聚糖的研究开发具有重要意义。由于多糖胶水溶液黏度大，不利于酶的接触、扩散，合理的酶解工艺也是决定法制备半乳甘露聚糖胶酶工业化的前提。本实验通过考察酶解条件（温度、时间、底浓、酶用量、ph）对提取效果的影响，为半乳甘露低聚糖的制备提供一定的数据。同时可以寻求制备半乳甘露低聚糖的最优条件。

3. 研究的基本内容与计划

以田菁种子和田菁胶为原料， （1）比较以田菁种子和田菁胶为底物的酶解效果。

（2）研究不同条件对酶解效果的影响。

（3）优化田菁酶解产半乳甘露低聚糖的工艺条件。

4. 研究创新点

比较以田菁种子和田菁胶为底物的酶解效果，优化并确定酶解工艺，为酶法制备田菁半乳甘露低聚糖的研究提供数据依据。