类芽孢杆菌纤维素酶多样性分析开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：纤维素酶解过程是多酶协同作用的结果，如何构建高效协同化的多酶体系在离子液体系中进行木质纤维素的原位酶解，这已经是国内外研究者关注的热点。传统研究方法是直接拿商品化的纤维素酶进行复配（既“纤维素酶鸡尾酒法”），或者通过经验模型来获得纤维素酶的优化组合。离子液体预处理可有效降低木质纤维素的抗性，促进媒介效率。但目前商品化纤维素酶混合物易被离子液体抑制，从自然界中寻求高效协同的纤维素酶进行离子液体中原位酶解木质纤维素已成为研究热点。

研究目的：本项目课题组从自然界中筛选到的类芽孢杆菌sp.llz1产生的纤维素酶本身具有多样性的特点入手，系统研究多样性的调控和产生机制，并直接探索多样性的纤维素酶在含有离子液体的酶解体系中的失活和强化机制

研究意义：煤炭石油等化石燃料的大量使用造成了环境经济社会等一系列问题，因此也推动了能源，材料，化工原料代替品的研究。可再生能源和清洁能源的利用势在必行。纤维素作为一种多聚糖，广泛存在于农业，林业废弃物中，是最丰富的的生物质资源。研究类芽孢杆菌纤维素酶的多样性分析有利于有效凭借生物技术将纤维资源充分利用，可有效缓解能源匮乏的世界性能源危机。

2. 研究内容和预期目标

主要研究内容：类芽孢杆菌LLZ1可产纤维素酶，纤维素酶是一种复合酶，包括内切β-葡聚糖酶，外切β-葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶，纤维素在纤维素酶的作用下被分解成葡萄糖。纤维素不溶于水，而在经过离子液体预处理可以使纤维素较好的溶解，离子液体预处理后的纤维素酶解工艺可分为两类，两步法将IL预处理后的纤维素经水洗涤除去残余IL后再用酶水解纤维素。而原位酶解将IL预处理后的纤维素不经水洗涤，直接加入酶进行水解，因此就需要纤维素酶有一定的IL耐受能力。纤维素酶是一类诱导酶，不同的可溶性底物（如甘油，CMC-Na,纤维二糖，乳糖，半乳糖，山梨糖，槐糖，蔗糖，淀粉等）诱导产生的不同的纤维素酶。将不同底物诱导产生的纤维素酶利用SDS-PAGE,测滤纸酶活，CMC-Na酶活和LC-MS/MS进行酶谱分析分析种类，酶活，揭示纤维素酶多样性。

预期目标：完成类芽孢杆菌纤维素酶的多样性分析课题实验的论文。

3. 研究的方法与步骤

sds-page电泳：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-page）及sds-聚丙烯酰胺凝胶（sds-page）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

lc-ms：是有机物分析市场中的高端仪器。液相色谱（lc）能够有效的将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱（ms）能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构（在某些情况下）和浓度（定量分析）的信息。强大的电喷雾电离技术造就了lc-ms质谱图十分简洁，后期数据处理简单的特点。lc-ms是有机物分析实验室，药物、食品检验室，生产过程控制、质检等部门必不可少的分析工具。

滤纸酶活：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素 能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(ph4.8，50℃，恒温lh)下， 以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以u表示。

4. 参考文献

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5. 计划与进度安排

2022年12月1日-2022年12月31日

课题文献阅读，调研，初步确定研究方案。

2022年2月15日-2022年3月15日