冷杉醇二萜合成酶的融合表达研究开题报告

1. 研究目的与意义

冷杉醇是香脂冷杉的芳香油树脂的主要成分，是制备龙涎香的一种重要的前体物质，是一种高附加值的二萜类化合物。来源于烟草的ClassII 和ClassI二萜合成酶（NtCPS2和NtABS）能将香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）通过2步反应生成冷杉醇。本课题为了实现在大肠杆菌中冷杉醇的高效合成，开展对二萜合成酶NtCPS2和NtABS的融合表达研究。拟采用模块化途径工程策略对这2个二萜合成酶构建融合蛋白研究，来提高代谢通量输送，从而提高冷杉醇的合成量。项目研究成果对系统构建生产冷杉醇的高效大肠杆菌代谢体系具有重要的意义。

2. 国内外研究现状分析

目前国内关于微生物代谢合成冷杉醇的相关研究较少，尚处在实验室阶段。国外的学者们经过努力取得了一些研究成果。2012年，Pilipp Zerbe 等人在冷杉树皮中发现了合成冷杉醇的双功能酶 AbCAS ,并进行体外酶活实验。同年，Sallaud 和他的同事在烟草中发现了冷杉醇的合成途径，并且发现在烟草中合成冷杉醇的酶是两个单功能酶Class II diTPS (NtCPS2) 和 Class I diTPS (NtABS)。Michel Schalk等人构建了基因工程大肠杆菌中的香紫苏醇生物合成途径，并通过高密度发酵使香紫苏醇的滴度达到了1.5g/L。Yongjin J.Zhou等人采用模块化路径工程策略在酿酒酵母中合成次丹参酮二烯，结果，二倍体菌株YJ2X在15L生物反应器中的滴度达到了365mg/L。Pamela P. Peralta-Yahya等人通过酶筛选和代谢工程相结合的方法，在大肠杆菌中的红没药烯滴度增加超过10倍，在酿酒酵母中的滴度达到了900 mg/L。

3. 研究的基本内容与计划

内容：

1.由于二萜合成酶在大肠杆菌中异源表达时可溶性较差，大部分为不可溶性蛋白，故对二萜合成酶基因进行改造，增加蛋白的可溶性表达量，从而提高酶活。

2.采用不同种类和长度的linker连接nttps2和ntabs的酶基因，构建出不同排列的重组质粒，转入大肠杆菌中，经过培养和表达，运用高效液相色谱检测产物冷杉醇的产量，最终筛选出高产菌株。

4. 研究创新点

1.采用生物合成法，具有极大的优势。与化学合成法相比较，合成路线大大缩短、不需要昂贵的试剂、不产生三废；与植物提取法相比较，产物单一，不需要复杂的分离纯化、生产周期短，产量高、生产成本低。

2.目前尚未见到有关二萜合成酶nttps2和ntabs的融合表达研究的相关报道。

3.可以实现冷杉醇的高效合成，具有广阔的应用前景。