长江中下游湖泊沉积物中四环素类、大环内酯类和β-内酰胺类抗生素的空间分布开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题意义

研究胞外聚合物质与抗生素的相互作用、影响及机制，探索eps在抗生素作用与细胞以及迁移转化中的作用。本研究可以运用到其它对人类有益的微生物培养方面来。eps与抗生素的相互作用会影响其去除效率，在对抗生素在生态系统中的处理中具有重要的理论意义和应用价值。

2.研究概况和应用前景

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

通过建立快速灵敏的分析方法，研究胞外聚合物质与抗生素的相互作用、影响及机制，探索eps在抗生素作用与细胞以及迁移转化中的作用。本研究可以运用到其它对人类有益的微生物培养方面来。eps与抗生素的相互作用会影响其去除效率，在对抗生素在生态系统中的处理中具有重要的理论意义和应用价值。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法

微生物胞外聚合酶（EPS）的提取采用修改后的加热法，分别对比脱除EPS和未脱除EPS的生物膜溶液中加入抗生素后细胞的变化以及抗生素的行为变化。

采用EEM-PFFCA分析和差分红外吸收光谱方法研究EPS与抗生素相互作用规律，了解抗生素等污染物在生物膜系统中的归趋并明晰EPS对生物膜抵御毒性冲击时的保护机制。

2、技术路线

生物膜溶液脱除EPS后冷藏待用、

EPS纯化、冷冻、干燥、

配置EPS-抗生素梯度混合溶液、

荧光分析、红外光谱分析、

反应器1、2、3中加生物膜混合液与抗生素、

定期取样进行HPLC分析，同时取样冷冻保存、

同时取样测溶解氧，冷冻样品测酶活力、

3、实验方案

（1）原始生物膜溶液混合均匀后测定其悬浮固体（SS）和挥发性悬浮固体（VSS）含量，生物膜混合液储存在4℃冰箱待用。采用修正的阳离子交换树脂法获得脱除EPS的生物膜样品，该方法能有效脱除EPS同时对细胞损伤较小。处理后将粗提EPS溶液和生物膜样品分离，生物膜重悬于等体积的蒸馏水中放置于4℃冰箱待用。粗提的EPS先用0.45μm的醋酸纤维素膜过滤，然后用分子截留量为10000的聚醚砜超滤膜浓缩，再加入5-6倍体积的去离子水稀释，以去除离子和小分子物质。最后对收集的EPS溶液进行冷冻干燥获得粉末状EPS。

(2)抗生素使用链脲佐菌素（ STZ）和四环素（TC）。将纯化后的EPS粉末溶解，配置一系列EPS（100mg/L）抗生素（0～30mg/L）溶液。每组溶液均置于25℃摇床12小时以确保络合平衡。之后，取5毫升用于荧光测试，剩余部分冷冻干燥后进行红外分析测试。EEM发射波长为300到600 nm，间隔0.5nm；激发波长为250到450nm，间隔10nm；扫描 速度为1200nm/min，激发发射狭缝均为10nm。为获取抗生素结合EPS后微观结构变化信息，使用红外光谱仪分别测量冻干后 EPS-抗生素粉末红外吸收光谱，计算差分红外吸收光谱进行分析。

（3）分别在2L的反应器（R1和R2）中加入1.8L 的生物膜混合液，25℃下运行144小时。在反应器R3中加入 1.8L脱除EPS的生物膜混合液，生物膜混合液的初始浓度均 为3.5g/L，抗生素初始浓度为1000μg/L。进水营养液所含乙酸钠641mg/L以及其它营养液。R2中加入叠氮化钠 （2.0g/L）以抑制微生物的活性作为参比。在不同时间段对样品进行取样5毫升，经过0.45微米滤膜过滤后进行HPLC分析。同时取样10毫升立即放置于-20℃冰箱冷冻保存测定生物膜代表性酶活力水平。抗生素被生物降解和吸附的去除效率分别表达为：

C生物降解量=CR1-CR2 C吸附量=C初始浓度-CR2

为考察生物膜EPS中吸附的抗生素量，需要对取样的生物膜中EPS进行提取分析。EPS提取采用改进的热提方法。 将离心后的污泥首先重悬浮于0.05%的氯化钠溶液中，然后在60℃水浴30分钟。然后将污泥混合液10000转离心15分钟。EPS中的抗生素也用相同方法测定。生物膜吸附的抗生素通过总吸附量减去EPS的吸附量计算得到。

(4)耗氧速率和酶活检测

在实验过程中监测生物膜混合液的耗氧速率。在不同时间点从反应器中取出40mL混合均匀的溶液于250mL锥形瓶，用溶解氧（DO）仪连续测定1分钟内的若干溶解氧值，将DO（mg/L）浓度对时间（min）作图，图像斜率即为耗氧速率OUR（mg/L/h）。超氧化物歧化酶（SOD）和 过氧化氢酶（CAT）分别反映微生物的活性大小以及微生物防御功能，用于分析生物膜微生物在抗生素冲击下的生物响应，酶活力由外公司代理测定。采用 Microsoft Office Excel 2010对数据进行方差分析（ANOVA）以检验数据间显著性差异。

4、可行性分析

本实验中涉及到的各种检测方法，均为本实验室常用方法，长期的应用积累了丰富的经验，为项目的实施提供了技术支撑。

本实验的参与人员，本人具有无机化学、有机化学、生物化学、基础微生物学等相关专业基础，同时通过查阅资料，已经具备了充足的相关理论知识及相应的实验操作技能，如无菌操作技术；实习指导老师具有扎实的专业基础知识和多年的研究实践经验。综上，该实验具有很高的可行性。

冻干后 EPS-抗生素粉末红外吸收光谱，计算差分红外吸收光谱进行分析。

4. 研究创新点

目前，国内外关于EPS 的研究主要围绕在EPS对水体中的重金属、多环芳烃以及其他富营养元素的吸附作用方面。虽然关于EPS对抗生素的影响的研究结论是显而易见的，但是，目前针对这一问题进行细致的研究并给出具体的实验结果的并不多，故本次毕业设计针对这一问题进行实验，深入探究EPS与抗生素的作用机制，从而了解影响效果，这对降低环境中抗生素危害具有较大的理论意义。本实验涉及的实验过程较为复杂，涉及相关知识较多，是巩固和拓展本科专业知识的良好机会。

5. 研究计划与进展

2020年1月—2020年2月：基础资料的收集，文献阅读；

对研究课题进行资料收集，通过前人的研究报告深入了解该实验。

2020年3月—2020年4月：具体实验的确定，进行实验；