菊芋内生固氮菌的定植和促生作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、国内外研究进展

1966年，dbereine首次成功地从热带禾本科植物点状雀稗(paspalum notatum)根际中分离出有较强固氮作用的雀稗固氮菌(azotobacter paspali)，根据固氮菌的生长特点提出联合共生固氮的概念。1997年baldani等将固氮菌划分为三类：自生固氮菌、共生固氮菌和内生固氮菌。植物内生固氮菌是指定植在植物体内，与宿主植物进行联合固氮的一类微生物。内生固氮菌的直接促生作用是通过生物固氮和产生的植物激素，除此之外，还可以将大气中的氮气固定，转化为nh4 的形式被植物直接吸收的同化或间接生成细胞结构组成中的生物氮。植物内的内生固氮菌可以促进宿主对周围环境的适应，同时其活性也受所在组织和细胞微环境的影响。近年来，国内外研究人员分别在不同地域的水稻(oryza sativa)、玉米(zea mays)、甘蔗(sacharum officinarum)等禾本科植物的组织中分离得到内生固氮菌，已经发现的植物内生固氮菌主要集中在固氮螺菌属(azospi-rilum)、肠杆菌属(enterobacter)、产碱杆菌属(alcaligennes)、草螺菌属(herbaspirillum)等，并对马铃薯、甘蔗、玉米等植物中的内生固氮菌的促生特性机制进行了研究。

菊芋(helianthustuberosus)是菊科向日葵属多年生草本植物，又称洋姜、鬼子姜，适应能力强，耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱。原产北美，经欧洲传入我国,是近年来发展较快的新型经济作物。菊芋可生产菊粉，通过菊粉酶可进一步生产低聚果糖和超高果糖浆等产品，还可以做燃料乙醇和生物柴油的原料。利用菊芋的抗逆性，在海水灌溉农业和防沙治沙方向也有应用。调查显示在生产实践中，菊芋所施用的氮肥量相比于其他作物较少，每hm²所需氮肥仅为水稻用量的50%。且产生的生物量巨大，每年每hm²可以收获80000 kg左右的菊芋块茎，以及40000 kg秸秆。综合分析其原因可能是由于菊芋自身的固氮作用。目前国内外对菊芋内生固氮菌的研究较少。

2. 研究的基本内容和问题

本实验以菊芋作为实验材料，将前期通过测定植物生长激素分泌特性及解磷活性综合筛选出的一种高效固氮菌，接入绿色荧光蛋白并回植到菊芋中，与空白组对比观察该菌株在菊芋中的定植分布情况，为该菌株的进一步研究提供参考和研究依据。

3. 研究的方法与方案

将前期通过测定植物生长激素分泌特性及解磷活性综合筛选出的三种高效固氮菌的回植。将接种内生固氮菌的菊芋植株以及未接种的菊芋植株移植到无菌蛭石的基质上，使用fahraeus缺氮营养液进行植物培养，以(yrh)2s04作为植物氮素营养添加。前一个星期进行闭光发芽，每天添加纯水培养，发芽后置于光照16h避光8h的培养箱，每三天添加一次营养液。经四十天的培养后取出菊芋块茎再次称重记录，计算其差值即是生物量。测定5个指标（全氮、硝态氮、蛋白质、硝酸还原酶、谷氨酰胺还原酶）综合选出菌效果最好的一株菌，扩增其的nifh基因，采用菌落pcr方法，以固氮菌为阳性对照，检测固氮酶的保守基因nifh。引物使用polf/polr，序列参考poly等人(franck poly et al., 2001)的文献。反应体系（50μl）：超纯水21μl，引物上下游各2μl，taq mix酶25μl。扩展反应程序：①95℃预变性5min，②95℃变性15s，③58℃退火15s，④72℃延伸1.5min，⑤72℃继续延伸5min，步骤2~4进行35个循环。pcr扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检验后，将亮度好、单一性高的特异性条带(380bp左右)进行切胶回收，连接peasy克隆载体(transgen code: cb101-01)转入大肠杆菌，使用引物m13f/m13r验证转化效果，并且选取阳性克隆交由金唯智测序公司进行测序。从genbank数据库中获取同源性高的菌株，应用软件megalign对分离菌株和参比菌株的16s rdna部分序列进行分析。

构建荧光蛋白标记菌株：利用质粒对菌效果最好的一株菌进行荧光蛋白标记，利用三亲亲和杂交的方法。供体细胞和辅助细胞分别在相应抗性的lb平板培养基上与37°c过夜培养，与此同时，受体细胞也在28°c过夜培养于含有50mg/ml氨苄青霉素的lb平板上。将供体细胞、辅助细胞和受体细胞以大约3:3:1的比例混合涂布于lb平板培养上，于30°c培养8h。使用接种环，刮取一环上述的混合细胞，划线培养于含有氨苄青霉素(50mg/ml)和四环素(50mg/ml)的lb培养基上进行筛选培养。能够在该培养基上生长的阳性克隆，将继续在含有抗生素以及不含抗生素的lb培养基上交替传代30次，并在荧光显微镜观察细胞的荧光反应。

将菊芋叶片浸泡于无菌水中20 min，利用70%的酒精以及2%的nacio溶液进行表面灭菌。最后用无菌超纯水进行冲洗4次后，使用含有萘乙酸(o.1 mg/l)的ms基础培养基进行组培培养。在25±1°c，16/8 h的光周期的无菌组培间中培养5-6周之后，将萌发的菊芋组培苗转移到的含半固体的hoagland营养液的无菌试管中。无菌组培苗在25±1°c的环境中继续生长3天，以适应新的生长环境。分别接种含有氨苄青霉素和四环素的菌种和不含氨苄青霉素和四环素的菌种，将这两组菊芋无菌苗及空白组无菌苗的根系浸没于10ml细胞浓度为105.106/ml内生细菌悬液中，30 min之后，用无菌超纯水进行冲洗，移除与菊芋根系表面松散结合的实验细菌。接种后的菊芋至于灭菌后的蛭石中，继续置于温度为25±1°c，光周期为16/8 h的组培室中进行培养。15天后，菊芋植株进行严格的表面灭菌后，用无菌刀片分为根系、茎秆和叶片三个部分。在无菌操作台上，使用徒手切片的方法制备不同植物组织器官的镜检切片，用荧光显微镜观察它在植物体内的定植情况。

4. 研究创新点

从菊芋中分离出一株通过生物固氮、IAA分泌合成等多种作用机制有效地促进植物的生长发育且回植效果好的菌株。

5. 研究计划与进展

2020.2-2020.3查阅文献设计实验

2020.4-2020.5进行实验

2020.6实验数据整理，撰写毕业论文