磷酸盐转运体基因对莱茵衣藻砷酸盐吸收、分配和形态转化的影响开题报告

1.课题意义、国内外研究概况、应用前景

1.1课题意义

砷污染已经成为全球性的环境问题，微藻是水环境中的初级生产者，可从水体环境富集大量的砷并介导砷形态的转化。有研究表明，微藻对As的吸收和转化受到磷酸盐的影响，但之前的很多研究都是在高磷高砷处理浓度下处理的，与现实水体中实际情况相差甚远，还需要展开更深层次的研究。因此，本课题以莱茵衣藻野生型（WT）和突变型ΔPHOX（缺失磷酸盐转运蛋白基因PHOX）为试验材料，旨在研究磷酸盐转运蛋白对微藻砷酸盐吸收转化的影响，为深入探索微藻对砷的代谢机制，进一步揭示磷酸盐对微藻砷酸盐代谢的影响奠定基础。

1.2国内外研究概况

1.2.1砷的理化性质与常见形态

砷（As）是一种广泛分布在自然环境中的类金属元素，在自然界中常存在以下4种化学价态：-3、0、 3和 5，包括无机砷和有机砷，其中无机砷主要有两种：亚砷酸盐（As(III)）和砷酸盐（As(V)）；有机砷主要包括一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA)、三甲基砷酸（TMA）、砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）和砷糖等。在海洋生态系统中，砷主要是以As(V)、As(III)、MMA和DMA的形式存在^[1]。

根据砷在生物中不同的细胞组分可分为水溶态，脂溶态和残渣态三部分。水溶态砷指的是储存在细胞内的可溶于水的砷化物，一般以As(V)，As(III)为主，有少量的MMA，DMA，砷糖等；脂溶态砷指的是细胞内的含砷脂质，结构复杂且含量较低；在经过水溶态和脂溶态连续提取后，剩下的就是残渣态砷，这类砷与细胞中不溶性物质相结合，主要以未知结构的阳离子形式存在^[2]。其中，微藻中最常见的砷形态有无机砷、甲基砷、及少量的砷糖砷脂等。

1.2.2砷的毒性及危害

砷的毒性受其总量影响，但更取决于其形态^[2]。一般认为，砷对人体的毒性大小为：二甲基亚砷酸（DMA(III)）一甲基亚砷酸（MMA(III)）As(III)As(V)二甲基砷酸（DMA(V)）和一甲基砷酸（MMA(V)）。而无机砷中As(III)对细胞的毒性最强，约为As(V)的60倍；砷与人体内蛋白质的巯基分子结合后，能够抑制多种蛋白酶的活性，阻碍细胞的呼吸，可能导致肺癌、皮肤癌和膀胱癌等多种癌症的产生^[3]。海洋生态系统中的砷能被鱼类、藻类、浮游植物等海洋生物吸收，在肝脏内转化，会导致生物体内的功能紊乱，影响海洋生物的生长。

1.2.3微藻对砷的吸收与转化

研究表明，无论是原核或真核藻类，As(V)均通过磷转运系统进入细胞，而As(III) 则通过水甘油通道蛋白或己糖透性酶进入细胞^[4]。As(V)进入微藻细胞的途径与微藻体内的磷代谢密切相关。研究表明，微藻对As(V)的吸收及产生的毒性随着环境中磷含量的增加而减小^[5]。另外，As(V)的吸收不但受到培养液中的磷含量影响，胞内磷含量的微小差异也会显著影响As(V)对微藻的毒性^[5,6]。

微藻对砷的转化包括砷酸盐的还原、亚砷酸盐的氧化、砷的甲基化、砷糖砷脂的合成以及砷的外排等（如图一）。砷进入微藻细胞后，存在着As(V)快速还原为As(III)的过程，即：As(V)在细胞内首先被砷酸盐还原酶或非酶促反应如还原型GSH还原为As(III) ，然后As(III)以As(III)-(GS)₃为底物通过MRP蛋白排出胞外或与GSH络合^[4]。而砷的氧化反应是微藻的重要砷解毒机制，微藻细胞可通过将毒性较高的As(III)氧化

为毒性相对较低的As(V)达到解毒的目的^[5]。另外，当微藻处于高浓度砷胁迫时会使砷发生甲基化，即砷酸盐被摄入微藻细胞后很快被还原为亚砷酸盐并生成MMA(V)和DMA(V)^[7]，这是微藻应对不良环境的一种砷解毒机制^[8]。海洋生物可以使无机砷甲基化并合成一系列含有核糖的砷化合物，统称为砷糖，目前砷糖砷脂的种类已知累计超过90种，但其合成途径仍未完全揭晓^[9,10]。最后，为了能在高砷酸盐浓度下生存，微藻能将吸收的砷快速外排到培养液中以适应高砷胁迫^[11]，通常外排的大部分砷形态为As(III)和As(V)。另外，除无机砷外排，As(V)在胞内被还原为As(III)后甲基化为有机砷（DMA、MMA），也可被外排^[12]。

图 1 蓝藻中的砷代谢^[13]

1.2.4磷酸盐对砷吸收的影响

磷、砷属于同族元素，As(V)是磷酸盐的类似物，可以通过磷酸盐转运蛋白被微藻吸收^[12]。磷酸盐对As(III)吸收也有影响，可能是磷酸盐与亚砷酸盐之间存在非竞争性抑制作用，改变了转运体的空间构象，也可能是磷酸盐影响了As(III)氧化为As(V)的速率造成的^[14]。

磷酸盐含量增加会抑制As(V)吸收，与胞内P含量上升、磷转运蛋白数量降低有关。研究表明，在缺磷条件下，微藻会对磷产生全局应激反应，即通过协调低磷可用性与细胞代谢之间的变化和减少细胞分裂和生长来实现长期存活，在低磷条件下磷酸酶的活性有不同程度的增加。PHOX首先被鉴定为在Volvox carteri中编码的胞外磷酸酶^[15]；Moseley等^[16]结果表明在24小时缺磷实验中编码胞外磷酸酶的衣藻属PHOX同源物的mRNA在细胞中增加~5000倍；而且在准备实验中发现，与野生型莱茵衣藻

WT相比，莱茵衣藻PHOX突变体在正常磷培养基内生长较缓慢甚至受到抑制，这种

情况可能与其磷吸收受阻有关。

目前已经在缺磷培养基中生长的衣藻细胞中表征了Pi转运^[17]。在磷缺乏时，Pi运输的Vmax增加约10倍。Pi的吸收涉及两种不同的动力学成分；一个（低亲和力）的Km约为10 μM，而另一个（高亲和力）的Km在0.1和0.3 μM之间。在营养充足条件下，低亲和力组分占总Pi吸收的约80％，但在缺磷24小时后，基本上所有摄取都通过高亲和力系统发生。以衣藻为例，它含有编码H /PO₄^3-（类似植物）和Na /PO₄^3-（类似动物）高亲和力Pi转运蛋白（分别为PHO84和PHO89）的基因。高亲和力Na /Pi同向转运蛋白PHO89的10个同源物在衣藻中编码，并且这些Pi转运蛋白B型蛋白（PTB）中至少4种的转录物在缺磷期间丰度增加（PTB2、PTB4、PTB5等）；另外还有四种Pi转运蛋白A型多肽（PTA）由与PHO84同源的基因进行编码，其中PTA4的转录物在缺磷期间丰度增加^[16]。据目前的研究可得，有一些磷酸通道蛋白对

藻细胞的磷吸收及运输有很大的作用，然而并未确定具体哪些磷酸盐通道蛋白是主控磷进入藻细胞的，以及与藻细胞对砷酸盐的吸收之间是否有关。

1.2.5磷酸盐对砷转化的影响

微藻对砷的转化也受到磷的制约。胞外磷酸盐与As(V)在被藻吸收过程中形成竞争关系，磷酸盐的存在抑制As(V)的吸收^[18]。另一方面，解毒过程一重要环节是胞内As(V)通过还原作用生成As(III) ^[19]。磷酸盐可以与As(V)竞争性结合相应的还原酶活性位点，从而影响As(V)的还原过程^[17,20,21]。更进一步，由于As(V)的毒性主要来自其对胞内磷酸盐正常代谢活动的干扰，这种干扰行为可以在胞内磷酸盐浓度提高时得以缓解^[6]。因此，细胞内外的磷酸盐可以从多方面对As(V)的毒性产生影响。

另外，Ronald等^[15]的实验表明在较低砷浓度下，当磷浓度较低时，Dunaliella tertiolecta能够产生多种复杂有机砷如砷糖、砷脂，而且在不同的砷磷比条件下，Dunaliella tertiolecta产生的砷糖砷脂的量与形态也有不同的变化。因为海洋环境中主要以As(V)为主，且砷含量较低，大约为1-2 μg/L；而且其磷含量也较低，大约为4.75-285 μg/L^[22]，所以推测在磷浓度和砷浓度较低时，微藻对砷的代谢主要是生成砷糖砷脂等复杂有机砷化物，而随着砷浓度的升高，微藻的解毒机制则主要是As(V)的还原及外排。

1.3应用前景

本课题从分子水平上对砷的吸收，生物转化的调节机制进行深入研究，通过对比莱茵衣藻及突变体在低磷酸盐水平下对砷酸盐吸收、形态转化的情况，进一步揭示了磷酸盐对微藻砷代谢的影响机制，这对于开发更有效的砷生物修复方法、降低砷对生态环境以及人体健康的风险具有十分重要的意义。