定殖对多环芳烃污染植物体内的定殖菌数量和芘含量影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

土壤是人类赖以生存和发展的重要基础。目前，由于土壤有机污染引起的植物污染风险已经成为全球关注的焦点问题之一^[1]。多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, pahs）是由两个或两个以上苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式稠合在一起的化合物^[2，3]。它们是一类普遍存在于土壤环境中，具有三致效应（致畸、致癌、致突变）的持久性有机污染物，能够被植物吸收积累，并通过食物链的传递严重危害动物和人体健康^[4，5，6]。因此，如何规避植物体内pahs污染风险，保障农业的健康、可持续发展成为研究者亟需解决的问题。芘作为pahs中四环污染物的典型代表，常被用作测定环境中pahs污染的指示物和pahs生物降解的模型分子。本研究以芘作为pahs代表性污染物，以小麦作为供试植株，以具有芘降解特性的植物内生细菌pw7为供试菌株，将具有芘降解特性的功能性内生细菌重新定殖到植物中，以期为利用功能内生细菌调控植物吸收降解pahs，进而有效地规避植物体内pahs污染风险提供新思路和途径。

国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

本项目拟以pahs中的芘为目标污染物，旨在将具有芘降解特性的植物内生细菌定殖到植物的基础上，研究不同定殖方式对植物体内定殖菌数量的影响及功能内生细菌对植物吸收积累pahs 的调控规律；探讨出更加合理高效的定殖方式。在此基础上，综合地评价利用植物功能内生细菌调控植物吸收有机污染物的可行性，探索出一条应用植物体内的微生态系统来有效规避有机污染风险的新途径，进而为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提供重要依据。

研究的内容

3. 研究的方法与方案

实验方案：

1.小麦水培试验

利用降解菌株PW7进行定殖研究，对其进行抗性标记，再将培养24 h的抗性菌株配成菌悬液，采用适合于植物修复的浸种、涂叶、浸根等方法接种，采集植物样品的根、茎叶、培养液，消毒捣碎涂布，进行菌落计数，以及菌落形态和芘降解特性测定，以确定其为接种的菌株，即定殖成功。

1.1 降解菌株抗性标记

将分离筛选的降解芘植物内生细菌PW7进行抗性标记：将目标菌稀释成一定浓度，在LB抗性平板上点菌，30℃培养2 - 4天，待有菌落长出后，挑取单菌落移入浓度较高的抗性平板上，并获取抗性菌落，使抗生素的浓度由低到高逐渐增大，直至挑选最稳定的抗性菌株。将抗性菌株在最高浓度（三种抗生素的终浓度均为100mgL¹）的三抗平板上连续转代5次以上，稳定突变菌株PW7的抗性。

1.2 芘污染霍格兰营养液配置

芘污染霍格兰营养液的配置：在Hoagland营养液中加入含芘甲醇母液(甲醇含量低于0.5)，共分为2个浓度、3种定殖处理方式和2个采样时间点 (表1-1)，每组设置3个平行。

表1-1不同芘污染处理组

2. 小麦侵染方法

挑取抗性标记菌株PW7到LB抗性培养基中30 ℃、150 rmin^-1活化48h，配成OD_600nm值为1.0的菌悬液，采用适合于修复植物的浸根、涂叶等方法接种。

（1）叶片涂抹接种：小麦种子经表面消毒，催芽、育苗48 h后，置于1/5 Hoagland营养液中，培养至株高约10 cm左右。分别用无菌药棉蘸菌悬液和无菌水涂抹叶片，也可采取喷雾的方法接种。

（2）浸根接种：小麦种子经表面消毒，催芽、育苗48 h后，置于1/5 Hoagland营养液中，培养至株高约10 cm左右。分别用鲜活菌液、无菌水对小麦进行浸根（OD_600nm=1.0）处理，浸根时间为6h。

三个处理组分别采用浸根、浸根并涂叶1次、浸根并涂叶3次的定殖处理方法。选择长势相同的植株，然后进行移苗。移入含有不同芘浓度污染的棕色广口瓶中。每瓶装有250 mL Hoagland营养液，种植12株小麦，置于人工气候箱中培养，温度设置为白昼25/20℃。培养过程中适量补充Hoagland营养液保持瓶中液面高度。培养8d，每4d采集植物样进行测定。实验中每个处理重复3次。

3. 植物生物量的测定

植物样品采集后，将植物根和茎叶分离，用蒸馏水充分淋洗，滤纸浸干植物表面水分，并分别测定植物根、茎叶的鲜重。将新鲜植物冷冻干燥3 d后，测定植物样品的干重。

4. 植物体内芘的提取与测定

植物样品中PAHs的提取和测定的方法参照文献(凌婉婷等, 2006)。其步骤如下：(1)冷冻干燥后的植物根和茎叶，充分研磨粉碎，然后称取一定量植物样于30 mL玻璃离心管中，用二氯甲烷和正己烷(V：V=1：1)溶液分3次超声萃取30 min，每次10 mL。(2)将全部萃取液过无水硫酸钠柱-硅胶柱净化，用10mL的二氯甲烷和正己烷(V：V=1：1)混合液洗脱。(3)将洗脱液收集至旋转蒸发瓶，40℃恒温浓缩至干，用10 mL甲醇定容，过0.22 μm孔径滤膜，采用高效液相色谱(HPLC)测定植物根和茎叶中芘含量，并计算芘浓度（mg/Kg）、芘积累量(ug/pot)、植物体内富集系数与传导系数。

植物体内PAHs积累量(A)：A = C M，C (mgkg¹)表示植物根或茎叶中PAHs浓度，M (gpot¹, 干重)表示每株植物根或茎叶的干重。植物体内PAHs的富集系数(PCF)：PCF = C_p / C_s，C_p表示植物体内PAHs浓度，C_s表示霍格兰营养液中PAHs浓度。PAHs在植物体内的传导系数(TF)：TF = SCF / RCF，SCF表示植物茎叶中PAHs的富集系数，RCF表示植物根中PAHs的富集系数。

5. 培养液中芘的提取与测定

吸取10 mL培养液于离心管中，加入等体积的甲醇，超声萃取30 min，过0.22 μm孔径滤膜，采用高效液相色谱(HPLC)测定培养液中芘含量(mg/L)，并计算其去除率。

6. 植物体内定殖菌的分离计数

植物样品的表面灭菌方法参考文献（陈小兵等, 2008）。具体步骤如下：（1）将新鲜植物样用无菌水冲洗干净后，用75%乙醇充分漂洗2－3 min后，无菌水冲洗数次；再用5% NaClO表面消毒5 min，无菌水冲洗数次。（2）将表面灭菌的植物样置于LB固体平板，30℃恒温培养72 h。若平板上无菌落长出，表明灭菌彻底。将表面灭菌的植物样置于灭菌研钵，用10 mL无菌水研磨均匀。（3）吸取上清液10倍稀释，涂布于无机盐抗性固体平板，30℃恒温培养72 h，待平板上长出菌落进行计数，每个处理设置3个重复。

可行性分析：

该研究有充足的理论基础支持，该课题所需的实验仪器及器材完备，实验材料可寻，实验操作方法清晰，具有较强的研究可行性。

4. 研究创新点

本项目在实验室前期研究工作的基础上，利用具有芘降解特性的植物功能内生细菌，弄清其在植物体内的定殖性能，研究结果可为利用植物体内的内生细菌来有效规避作物有机污染风险提供重要思路和途径。

5. 研究计划与进展

2015年3月，小麦水培实验，降解菌株的抗性标记。

2015年4月-5月探讨内生细菌在植物体内的定殖后对植物体内定殖菌数量分布及植物吸收降解芘的影响。

本项目拟以pahs中的芘为目标污染物，旨在将具有芘降解特性的植物内生细菌定殖到植物的基础上，研究不同定殖方式对植物体内定殖菌数量的影响及功能内生细菌对植物吸收积累pahs 的调控规律；探讨出更加合理高效的定殖方式。在此基础上，综合地评价利用植物功能内生细菌调控植物吸收有机污染物的可行性，探索出一条应用植物体内的微生态系统来有效规避有机污染风险的新途径，进而为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提供重要依据。