施用畜禽粪便土壤中抗生素抗性基因种类和丰度研究开题报告

全文总字数：3824字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

抗生素的发现和大规模生产使用是人类医学史上的巨大进步,挽救了数以亿计的病人。但是细菌存在不同的对抗抗生素的机制, 临床上陆续出现了各类抗生素的多重耐药菌甚至是“超级细菌”，如果抗生素耐药性得不到有效控制,到2050年全球每年因耐药菌感染的死亡人数可能将达一千万。^［1］抗生素滥用的环境污染问题近年来已引起了日益广泛的关注。在畜禽养殖业，抗生素的长期滥用能够诱导增加动物肠道内的抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, args）^［12］。args经动物排泄物进入环境，将对养殖区域及其周边环境（例如土壤环境）造成潜在基因污染。args可在基因移动元件（mobile genetic elements, mges）的协助下在不同环境中的不同微生物之间传播和扩散，对公共健康、食品和饮用水安全会构成非常大的威胁^［2］。因此，控制环境微生物的抗生素抗性对于维持人类健康非常重要。对环境微生物抗生素抗性的有效控制，需要我们深入理解细菌args的多样性和传播机制。我国是抗生素使用大国，但在args的环境行为和风险评估方面的研究还较为落后。因此，研究土壤抗生素抗性细菌中args的多样性具有非常重要的意义。

与传统的化学污染物不同，抗生素抗性基因由于其固有的生物学特性,例如可在不同细菌间转移和传播甚至是自我扩增，可表现出独特的环境行为^［3］。畜禽粪便还田和城市再生水灌溉已成为土壤中args的主要来源。据统计,每年有超过 8 000t的抗生素投入畜禽养殖业,用于动物的催速生长和疾病治疗^［4］。未经吸收的抗生素随着动物尿液和粪便排出体外,这些未经处理并含有抗生素残留的粪便作为有机肥施入农田,使土壤中args的丰度及多样性发生变化,造成环境污染^［3］。我国长三角流域土壤中抗生素的含量随土地利用类型的不同而差异显著,呈现农田园林林地^［5］,农田土壤抗生素含量最高值达395.55 μg/kg。土壤中逐年增加的抗生素对土壤中args的积累起到了正向选择压力的作用，而且土壤中抗生素含量、土壤ph、有机质都对抗性基因存在影响。^［6］

现阶段对抗生素抗性细菌及args已有较为系统的研究, 对各类已知args的分子机制已有较为清晰的认知, 主要包括以下几类: (1)通过对抗生素的降解或取代活性基团, 改变抗生素的结构, 使抗生素失活;(2)通过对抗生素靶位的修饰使抗生素无法与之结合而表现出抗性; (3)通过特异或通用的抗生素外排泵将抗生素排出细胞外, 降低胞内抗生素浓度而表现出抗性; (4)其他抗性机制包括在细胞膜上形成多糖类的屏障减少抗生素进入细胞内^［7］。土壤由于具有丰富多样的微生物，因此是天然的args基因库^［6］。研究证明土壤中的args具有非常高的多样性，其来源分为本底存在和外源汇入两类^［9］。土壤本底抗性是指土著抗生素抗性菌(antibiotic resistance bacteria, arb)的基因组上存在args的原型片段以及没有表达的潜在args片段。外源汇入是指受人类活动等因素的影响, 外源微生物携带进入土壤环境的args，例如；畜禽粪肥作为肥料施入土壤可向土壤输入大量的args^［9］。要正确评估args的生态风险、在环境中的分布、传播途径和机制, 需要对各个环境介质中的抗性细菌中args的组成、基因环境和传播能力进行研究。现阶段研究args多样性的研究中，确定args的潜在宿主菌是常见的难点。通过直接筛选环境中的抗性细菌，研究其args的组成组成、基因环境和传播能力，可以为以dna测序为基础的研究提供可靠的args宿主信息，这对我们深入理解args作为一个新型环境污染物的环境行为，并在此基础上对其采取有效措施加以控制有很大帮助。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

表征抗生素抗性细菌中args的组成、基因环境和传播能力

研究内容

3. 研究的方法与方案

实验方案

1）抗性细菌筛选：从祁阳的土壤站中取部分土壤后，首先在选择培养基上（含菌株所抗药物）培养菌株。初选生长的菌株做梯度稀释，再次在选择培养基上培养。生长出来的菌株既完成了复选工作。所筛选出的菌株即认为是抗性菌株。

2）抗性细菌鉴定： 提dna：加800ulctab，1ml5mnacl,充分混匀后，在65度下水浴10min，加7.8ml氯仿异戊醇，充分混匀，在20度10000转下离心10min，去上清液，加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），充分混匀，在20度10000转下离心10min，取上清液，再重复上述步骤直到中间层不出现白色液体，加0.6倍体积的异戊醇，轻微摇晃，分装到2ml的离心管，在4度，16000转下离心1h，去上清液，加1ml70%的乙醇，在4度，16000转下离心15min，去上清液，各加50ul的水。扩16s rrna pcr：pcr 反应体系为25μl,包括10μl 2×lightcycler 480 sybrgreen i master mix (roche 公司,美国),终浓度为1μm的上下游引物(使用27f/1492r基因引物),1μl dna模板和12μl灭菌超纯水。pcr反应运行程序为:95⁰c预变性5min,40个循环包括95⁰c变性15s, 55⁰c退火1min,72⁰c延伸 30 s；72⁰延伸 5min^［10］。后进行blast鉴定

4. 研究创新点

本研究的特色和创新之处：采用全基因组草图测序的方法研究抗生素抗性细菌中抗性基因的多样性和功能，能够将抗性基因与具体的抗性表型联系起来。

5. 研究计划与进展

2019年3月11日 开题报告

2019年3月到4月 阅读相关文献

2019年3月到4月 对土壤中的菌进行筛选和测序