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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 1.选题意义 为了探究噬菌体疗法在农业领域的应用效果及稳定性，本研究以番茄土传细菌性青枯病（致病菌为青枯菌Ralstonia solanacearum）为研究对象，探究多株不同来源的裂解性噬菌体抑制青枯菌入侵番茄根际的效果及其对青枯菌致病相关特征的影响，为利用噬菌体生态防控土传病害奠定理论和技术基础。 2.国内外研究状况 青枯病是由青枯菌引起的一种细菌性维管束病害(Hayward 1991)。目前在我国南方（如：广东、广西、江西、湖南、浙江）等地发病严重。青枯菌分布在除南极洲以外的所有大陆，其寄主由20 世纪90 年代报道的200 余种，迅速扩大至2007年报道的450 余种(Izadiyan Taghavi 2013)，充分地体现了其高度的环境适应能力。青枯菌分类地位复杂，也是其环境适应进化的充分证据。Gillings等提出青枯菌复合种的概念(Gillings Fahy 1994)，用来表征青枯菌种内基因型和表型的多样性。作为复合种，青枯菌在与寄主长期协同进化过程中，表现出广泛的生态和寄主适应性，并演化出明显的生理及致病力分化等表型特征差异(Genin et al. 2004)。青枯菌这种强适应能力也使得我们不得不从进化的角度思考当前的土传病害防控策略，并针对病原菌的快速环境适应能力调整策略。 根际有益细菌和真菌在土传病害生态防控中发挥着重要作用(Lugtenberg Kamilova 2009; Jousset etal. 2011)，相关研究和应用较多。根际噬菌体（细菌病毒）的数量是细菌的 10 倍以上(Clokie et al. 2011)，然而相对于细菌和真菌，其在土传病害生态防控中的作用却被忽视了。近年来，出于对病原微生物抗生素抗性风险等的担心，噬菌体疗法正引起人们的关注(Salmond Fineran 2015; Wang et al. 2017)。此外， 随着测序和培养技术的发展，海洋(Breitbart et al. 2002)、湖泊(Sime-Ngando et al. 2011)、肠道等(Manrique et al. 2016)环境中的噬菌体资源不断被解析。同样，土壤中存在着遗传信息独特的噬菌体类群(Breitbart Rohwer 2005)，它们可能在根际物质循环、微生物群落结构演化和土壤抑病功能提升中起着重要作用。 随着细菌对抗生素耐药性的增强, 如今利用噬菌体进行细菌病害防治越来越受到人们的重视。与抗生素相比, 噬菌体因其特异性强、 副作用少、 增殖能力强且不易产生抗性等优点在医学和食品上已较为广泛应用；在作物中，利用噬菌体进行细菌性病害防治近年来也逐渐被人们重视及开发。20世纪初日本学者分离到噬菌体P4282（Ozawa et al., 2001;Tanaka et al., 1990）和PK101（Toyoda et al., 1991），用于控制青枯病。Tanaka等（1990）用含噬菌体的无毒青枯菌株M4S对烟草进行预处理，可有效降低青枯病的发病程度；用噬菌体和M4S菌株共同进行处理则效果更佳。但这些噬菌体的寄主范围狭窄，只能侵染一部分青枯菌。而青枯菌易变异，种内具有复杂的遗传多样性，细菌受体在噬菌体-细菌结合所需位点发生单一突变就可能使细菌对噬菌体产生抵抗力。但这种抗性并不是免费的，如宿主细菌细菌丢失鞭毛受体，获得了对噬菌体的抗性，但可能会影响其运动能力或资源的获取能力，从而降低其致病能力。青枯菌专性噬菌体是否会降低青枯菌的环境适应能力，从而提高生防效率有待进一步研究。 3.应用前景 利用不同噬菌体去侵染番茄青枯病原菌，研究进化后的青枯菌致病相关的特性，从进化学角度去揭示噬菌体防控青枯菌入侵番茄根际的机制，对噬菌体资源应用于生物防控具有重要意义。
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| 参考文献： Breitbart, M. Rohwer, F. (2005). Here a virus, there a virus,everywhere the same virus? TrendsMicrobiol, 13, 278-284. Breitbart, M., Salamon, P., Andresen, B., Mahaffy,J.M., Segall, A.M., Mead, D. et al. (2002). Genomic analysis of uncultured marine viral communities. PNAS, 99, 14250-14255. Clokie, M., Millard, A., Letarov, A. Heaphy,S. (2011). Phages in nature. Bacteriophage 1: 31–45. Genin, S., Angot, A., Cunnac, S., Occhialini, A.,Peeters, N. Boucher, C. (2004). Pathogenicity determinants and genomicsof Ralstonia solanacearum. Phytopathology,94, S121-S121. Gillings, M.R. Fahy, P. (1994). GenomicFingerprinting - Towards a Unified View of the Pseudomonas-SolanacearumSpecies Complex. Bacterial Wilt,95-112. Hayward, A.C. (1991). Biology and Epidemiology ofBacterial Wilt Caused by PseudomonasSolanacearum. Annu. Rev.Phytopathol., 29, 65-87. Izadiyan, M. Taghavi, S.M. (2013). Host RangeVariation and Genetic Diversity of Iranian Isolates of Ralstonia Solanacearumfrom Potato and Tomato with Rapd and (Gtg)5-Pcr. Journal of Plant Pathology, 95, 87-97. Jousset, A., Schulz, W., Scheu, S. Eisenhauer,N. (2011). Intraspecific genotypic richness and relatedness predict theinvasibility of microbial communities. ISMEJ., 5, 1108-1114. Lugtenberg, B. Kamilova, F. (2009).Plant-growth-promoting rhizobacteria. AnnuRev Microbiol, 63, 541-556. Manrique, P., Bolduc, B., Walk, S.T., van der Oost,J., de Vos, W.M. Young, M.J. (2016). Healthy human gut phageome. PNAS, 113, 10400-10405. Salmond, G.P. Fineran, P.C. (2015). A centuryof the phage: past, present and future. Nat.Rev. Microbiol., 13, 777-786. Schonfeld, J., Heuer, H., van Elsas, J.D. Smalla, K. (2003). Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearumin soil on the basis of PCR amplification of fliC fragments. Appl. Environ. Microbiol., 69,7248-7256. Sime-Ngando, T., Lucas, S., Robin, A., Tucker, K.P.,Colombet, J., Bettarel, Y. et al. (2011). Diversity of virus-host systems in hypersaline Lake Retba, Senegal. Environ. Microbiol., 13, 1956-1972. Wang, X.F., Wei, Z., Li, M., Wang, X.Q., Shan, A.Q.,Mei, X.L. et al. (2017). Parasitesand competitors suppress bacterial pathogen synergistically due toevolutionary trade-offs. Evolution,71, 733-746. Wei, Z., Huang, J.F., Hu, J., Gu, Y.A., Yang, C.L.,Mei, X.L. et al. (2015). AlteringTransplantation Time to Avoid Periods of High Temperature Can EfficientlyReduce Bacterial Wilt Disease Incidence with Tomato. PLoS One, 10. Wei, Z., Yang, X., Yin, S., Shen, Q., Ran, W. Xu, Y. (2011a). Efficacy of Bacillus-fortified organic fertiliser incontrolling bacterial wilt of tomato in the field. Applied Soil Ecology, 48, 152-159. Wei, Z., Yang, X.M., Yin, S.X., Shen, Q.R., Ran, W. Xu, Y.C. (2011b). Efficacy of Bacillus-fortifiedorganic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field. Appl. Soil Ecol., 48, 152-159.
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2. 研究的基本内容和问题
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研究目标
（1）研究不同来源噬菌体对番茄青枯病的防控效果；
（2）研究与不同噬菌体相互作用，进化后的青枯菌致病相关特征的变化
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1. 研究方法
（1）供试菌株及培养
强致病力青枯菌QL-Rs1115：本实验室从南京市麒麟镇发病番茄植株中分离获得对番茄具有强致病力的青枯菌QL-Rs1115 (Wei et al. 2011a)。
噬菌体：四株裂解性噬菌体NJ-P3，NB-P21，NC-P34，NN-P42分别分离自江苏南京、浙江宁波、江西南昌和广西南宁。
NA培养基：葡萄糖10 g/L-1、蛋白胨5 g/L-1、酵母浸膏3 g/L-1、酵母粉0.5g/L-1，调节pH 7.2-7.4，115 °C高压灭菌30 min。
青枯菌选择性培养基（SMSA）：在1000 mL改良NA培养基中依次加入1 % TTC 50 mg、结晶紫50 mg、多粘菌素100 mg、杆菌肽20 mg、氯霉素5 mg、放线菌酮50 mg、青霉素0.5 mg。
（2）研究方法
育苗盘——盆栽（田间）系统（方法1）
研究方法参考(Wei et al. 2015)，效果见图4D，用于研究青枯菌在不同噬菌体处理番茄根际的存活数量及侵染能力，评价进化后的青枯菌的致病性变化。Micro-Tom 番茄种子经表面消毒后，在营养琼脂平板上进行无菌催芽，发芽的种子移植到9孔育苗盘中（装有灭菌基质或土壤）。待番茄植株长出3片真叶，按实验设计进行接种处理。考察各处理番茄植株的发病率，生物量、根际病原菌的数量。田间试验中，番茄苗（农户自选品种）进接种处理后，移栽到在田间塑料大棚，田间小区设计方案参照(Wei et al. 2011b)。
定量检测根际青枯菌的数量（方法2）
采用定量PCR或者选择性培养基测定番茄根际生防菌和青枯菌总量。采集根际土后，用试剂盒提取土壤 DNA。青枯菌特异性引物为fliC F：5′-GAA CGC CAA CGG TGC GAA CT-3′，fliC R：5′-GGC GGC CTT CAG GGAGGT C-3′(Schonfeld etal. 2003)。病原菌的SYBR Green 荧光定量PCR采用陈巧玲等所描述的方法。
青枯菌的碳源利用特征研究方法（方法 3）
研究进化前后青枯菌的碳源利用谱、利用速率和最大生物量,方法参考Wei et al., 2015。采用微培养系统，青枯菌于TSA平板上生长48 h，去除内生碳源。转接至 TSA 液体培养基中过夜培养，用生理盐水（0.85%）洗3遍，调整至OD 600 为0.5。接96孔板中，细菌初始OD600为0.05。96 微孔板每孔加入150 L含有单一碳源的OS基础培养基和终浓度0.2%碘硝基四氮唑紫，碳源终浓度为 10mM，96 孔板置于25℃ 170 r/m培养。在不同时期利用酶标仪测定体系中的青枯菌OD600，若最终OD6000.05表示该资源可以被青枯菌利用。
青枯菌运动特性的研究（方法4）
培养基中琼脂含量为0.2%，平板中心点接2 L过夜培养的菌悬液(OD600为0.5)，30℃培养48 h后，用十字交叉法测定菌移动区域直径，评估青枯菌的泳动swimming能力。
青枯菌致病力的研究（方法5）。
利用拟南芥体系评价青枯菌的致病力。表面消毒的拟南芥种子播种在MS固体培养基上，7天后选择长势相同的拟南芥苗移栽到新的MS培养基上，3周后接种青枯菌悬液。观察并记录拟南芥的发病情况。
2. 技术路线
3. 实验方案
（1）盆栽研究噬菌体控制土传青枯病效果。采用育苗盘盆栽系统研究4株噬菌体防控土传青枯病发生的效率和抑制根际青枯菌入侵的能力。主要记录番茄植株发病等级并采用定量PCR测定根际青枯菌的数量。
（2）青枯菌进化突变后的资源利用能力。采用微孔板培养系统研究在不同噬菌体胁迫下进化的青枯菌利用根系分泌物资源谱（利用碳源种类），评价其生存能力。
（3）青枯菌进化突变后的运动特性。利用平板法研究在不同噬菌体胁迫下进化的青枯菌的泳动swimming能力。
（4）青枯菌进化突变后的致病性。温室盆栽系统研究进化后的青枯菌对拟南芥的侵染能力。对4周大的拟南芥苗接种青枯菌，在盆栽结束时统计发病的拟南芥的株数来评价不同处理进化后的青枯菌致病能力的变化。
4. 实验可行性分析
利用青枯菌专性噬菌体防治青枯病的研究近年来已有报道，且有研究表明噬菌体会影响宿主细菌的生理特性。所以本研究理论上是可行的，但噬菌体对农业环境中土传病原菌的影响机制尚待研究。
4. 研究创新点
本研究从试验进化学的角度去研究噬菌体防控土传青枯病的机制。
5. 研究计划与进展
2018.12-2019.01 开展不同噬菌体防控番茄青枯病的温室盆栽试验
2019.02-2019.04 盆栽结束后，从番茄根际分离进化的青枯菌，并检测其碳源利用/运动性/致病能力等
2019.05-2019.06 数据分析，攥写论文，课题总结并进行论文答辩。
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